专利名称：表达外源基因的重组猪细小病毒vp2病毒样粒子的制作方法
技术领域：
本发明涉及在腺病毒表达系统中表达外源基因的重组猪细小病毒(PPV) VP2病毒样粒子的构建 及应用，属于基因工程疫苗领域。
二背景技术：
PPV (Porcine Parvovirus)不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，而且能够引起多种猪病。 VP2是病毒粒子主要成分，约占80%，在自然状态下可自主装配。VP2具有良好的免疫原性，众多的 科学家利用VP2的良好免疫特性构建重组疫苗来预防本病，取得了很好的效果，同时还是具有血凝活 性的物质。Martinez等将PPVVP2基因克隆到杆状病毒表达系统中，并成功地在昆虫细胞中高效表达， 表达的VP2多肽能自我装配成病毒样粒子(Virus-Like Particles, VLPs)，用其免疫母猪能诱导产生免疫 应答。尽管未见有关该种疫苗进一步研究和应用的报导，但是VP2基因在体外表达的蛋白能自我包装 成病毒样粒子的特性，为重组多价亚单位疫苗的研究打下了基础。Sedlik等将PPV VP2和包含淋巴细 胞脉络丛脑炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸的抗原决定簇区相连，然后克隆于杆状病毒表达载体 PACYM，转染表达PPV:VP2-LCMV蛋白。利用该重组蛋白免疫鼠可以诱导强烈的CTL反应，在体内 持续时间长达9个月，并可抵抗致死量的LCMV攻击。之后，Sedlik又将LCMV的CD8+T细胞抗原 决定簇多肤共价结合于l nm的脂质微球上，与上述表达的PPV:VP2-LCMV蛋白一起进行了免疫小鼠 的比较，结果发现二者都能诱导产生很强的CD8+T细胞反应。但是PPV:VP2-LCMV携带的抗原量比 脂质体微球少100倍时，诱导的CTL活性仍比脂质体微球诱导的CTL活性高6倍，并且只有 PPV:VP2-LCMV免疫的小鼠能抵抗致死量的LCMV的攻击。Richard等用PPV VP2共价结合乙肝病毒 HBSAg的抗原决定簇区多肽，然后免疫小鼠诱导产生了很强的针对插人的HBSAg决定簇的T细胞反 应，并能抵抗乙肝病毒的致死性攻击。这些结果均说明PPVVP2病毒样粒子作为一种抗原的转运载体 具有很大的潜在价值，并为进行多价重组疫苗的研究创造了良好的条件。
猪圆环病毒2型(PCV2)与多种猪病相关，主要引起仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综 合征(PDNS)、繁殖障碍、猪呼吸综合征、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴腺炎、也可能引起渗出性皮炎、 仔猪先天性震颤等。尤其PMWS，自1991年加拿大首次报道以来，现已证实呈世界性流行,我国的一 些猪场也普遍存在本病。大量报道证明易感猪单独感染PCV2后会出现典型的病理变化，但不表现或 只出现轻微的临床征状，但在感染其他病原如PPV、 PRRSV、各种致病菌等、饲养条件改变或外界刺 激条件下表现临床征状。PCV2与PPV和PRRSV混合感染引起的PMWS很难治愈，国外研究表明在 实验条件下PCV2与这两种病毒混合感染可以复制出典型的PMWS,但单独感染这三种病毒不表现临 床征状,因此有人认为PCV2与其他病原可能有协同作用，但其机理还不清楚。猪一旦感染圆环病毒病， 无有效治疗的药物，因此研究安全、有效的疫苗是预防本病的主要途径。已有研究表明PCV2 Cap蛋 白成为疫苗研究的候选基因，PCV2抗原决定簇主要集中在Cap蛋白第47 85， 165 200及C端最后 4个氨基酸。
三、发现内容
技术问题
本发明目的在于1)利用腺病毒表达系统构建表达外源基因的重组PPV VP2病毒样粒子的方法， 及以该重组PPV VP2病毒样粒子作为一种抗原转运载体进行多价重组疫苗的研制；2)构建了在腺病 毒表达系统中表达2型猪圆环病毒Cap基因的重组PPV VP2病毒样粒子及其在疫苗上的应用。
技术方案表达外源基因的重组猪细小病毒(PPV) VP2病毒样粒子，其特征在于，是利用腺病毒表达系统 表达PPVVP2C端1640bp基因片段AVP2构建而成的PPVVP2病毒样粒子。构建方法为
1) 获取AVP2目的基因并克隆入pMD9-T载体
以GenBank中基因登录号为NC:001718的NADL-2菌株基因序列为模板，用软件Primer 5.0设
计引物
P1 5 '-gaggtaccgggggggttggt卿國3' P2 5 '-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3'
分别加入ATp"I和Afe/1酶切位点，以PI, P2引物扩增PPV弱毒株NADL-2的DNA,扩增的PCR 产物含VP2基因1740 bp中的1640 bp片段AVP2，在1%琼脂糖凝胶上电泳后，回收并将其与pMD19-T Vector连接，转化￡.co//DH5a，碱裂解法提取质粒，《p71和Afort双酶切鉴定，获得阳性质粒pTAVP2;
2) 重组质粒pAd-AVP2的构建与鉴定
利用双酶切位点A^ I/AtoI将目的片段克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中；用A:/7wIM^ I双酶切及 测序分析进行鉴定，命名为rShuttle-AVP2;用尸附e I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与pAdEasy mVector在1.8 kV、 25 和200 Q条件下电转化至大肠杆菌A/57W感受态细胞，使rShuttle-AVP2 与pAdEasyTM Vector发生同源重组，转化至DH5(x宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR，酶切鉴定 重组是否正确，构建成重组质粒，命名为pAd-AVP2;
3) 重组PPV VP2病毒样粒子的获得
将重组质粒pAd-AVP2转染转染HEK-293A细胞，获得重组腺病毒pAd-AVP2，重组腺病毒表达 的AVP2蛋白在该重组腺病毒感染的HEK-293A细胞中自我装配成病毒样粒子PPV:VLPs，即为构建 的在腺病毒表达系统中表达外源基因的重组PPVVP2病毒样粒子。
上述重组PPVVP2病毒样粒子作为抗原转运载体的应用所获得的产品，其特征在于，将表达2型 猪圆环病毒PCV2 Cap的165-200位氨基酸基因(ACap)嵌合在PPV VP2病毒样粒子AVP2的N端，然 后克隆到腺病毒表达系统中所获得的病毒样粒子或疫苗产品。
有益效果
本发明的特点和优点如下
1、 本发明应用的腺病毒表达系统是缺失了El和E3基因的人腺病毒血清5型(Ad5)，具有无致病 性、复制效率高、克隆空间大(可容纳7.5 Kb的外源片段)、能在大多数哺乳动物细胞和组织中表达重 组蛋白、在同种细胞和组织中可同时表达多个基因等特点，可对外源基因进行正确的翻译和修饰，使 表达的蛋白具有与天然蛋白相同的生物活性。使用该系统构建的重组病毒用于猪体，还可以避免由于 猪体自身产生的腺病毒抗体影响免疫效果。
2、 利用腺病毒表达系统构建表达外源基因的重组PPVVP2病毒样粒子将PPVVP2C端基因片 段AVP克隆到腺病毒表达系统中，转染HEK-293 A细胞，RT-PCR、间接免疫荧光及Western-blotting 实验结果表明，AVP2蛋白在HEK-293 A细胞中高效表达；表达产物的粗提物用3%的磷钨酸负染后 经透射电镜观察，在电镜下可以看到大量病毒样颗粒子存在，呈圆型，直径为30nm左右，其形态大 小均与全病毒粒子相似。
3、 利用腺病毒表达系统构建了表达外源基因的重组PPVVP2病毒样粒子，以PPVVP2病毒样粒 子作为一种抗原转运载体，为重组多价亚单位疫苗的研制打下了基础。
4、 本发明以PPV VP2病毒样粒子作为PCV2抗原的转运载体将PCV2 Cap的165-200位氨基酸 (ACap)基因嵌合在PPV VP2的N端(AVP2)，然后克隆到腺病毒表达系统中，转染HEK-293 A细胞， RT-PCR、间接免疫荧光及Western-blotting实验结果表明，AVP2蛋白在HEK-293 A细胞中高效表达； 表达产物的粗提物用3%的磷钨酸负染后经透射电镜观察，在电镜下可以看到大量病毒样颗粒子存在， 呈圆型，直径为30nm左右，其形态大小均与全病毒粒子相似。5、本发明构建的重组腺病毒表达的嵌合病毒样粒子，免疫小鼠实验结果显示在首免后第14天 实验组能检测到PCV2特异性抗体，抗体的滴度随着时间的延长而增高，在二免后35天时杭体水平达 最高为1:10000; 二免后35天，实验组PPV中和抗体滴度为20， PCV2中和抗体滴度位16; 二免后 28至42天实验组和对照组Con A/LPS刺激指数差异极显著。说明重组的嵌合病毒样粒子具有良好的 PPVVP2和PCV2Cap的免疫原性，免疫动物后可诱导产生保护性免疫反应。
6、本发明构建的重组腺病毒表达的嵌合病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]作为一种蛋白质载体多价 重组疫苗不但安全性高、价廉，而且可以有效的预防PCV2感染及由PCV2与PPV混合感染而导致的 PMWS的发生，是一种新型的安全有效的后选疫苗。 四
图1: PPVAVP2目的基因扩增片段
图2:重组质粒rShuttle-AVP2尺pj I /Wo/1双酶切酶切鉴定图谱 图3:重组质粒pAd-AVP2尸acl酶切鉴定图谱
图4:重组腺病毒rAd-AVP2间接免疫荧光图重组腺病毒(a)和细胞对照(b) 图5:表达AVP2蛋白的免疫转印鉴定 图6: PPVVP2病毒样粒子电镜图 图7: PCV2 ACap目的基因扩增片段
图8:重组质粒rShuttle-ACap-AVP2《戸I/AfeH双酶切酶切鉴定图谱 图9:重组质粒pAd-ACap-AVP2 Pacl酶切鉴定图谱 图10:重组病毒间接免疫荧光图猪抗PPV(a)和PCV2(b)血清的对应孔， 细胞对照孔(c)
图ll:表达嵌合蛋白的免疫转印鉴定猪抗PPV(1)和PCV2(2)血清，细胞对照孔(3)
图12:嵌合病毒样粒子电镜图
图13: PCV2特异性抗体图
图14:淋巴转化实验图(ConA刺激)
图15:淋巴转化实验图(LPS剌激)
图16:嵌合病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)构建示意图
五具体实施例方式
1、表达外源基因的PPVVP2病毒样粒子的构建及应用
1) 获取AVP2目的基因并克隆入pMD19-T载体
以GenBank中NADL-2基因登录号为NC:001718基因序列为模板，用软件Primer 5.0设计引物 分别加入Kp"I和A^I酶切位点。PPV弱毒株(NADL-2)购自中国兽药监察所。 P1 5 '-gaggtaccgggggggttggtgtgt-3' P2 5 '-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3'
以Pl， P2引物扩增含VP2(1740 bp)基因C端1640 bp的片段(图1)。扩增的PCR产物在1%琼脂 糖凝胶上电泳后，回收并将其与pMD19-T Vector连接，转化DH5a，碱裂解法提取质粒，《pwl 和A^I双酶切鉴定，获得阳性质粒(pTAVP2)。
2) 重组质粒pAd-AVP2的构建与鉴定
利用双酶切位点(《F2lMfert)将目的片段克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中；用K/M/M^I双酶切(图 2)及测序分析进行鉴定，命名为rShuttle-AVP2;用Ane I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与腺 病毒骨架载体(pA犯asyTMVector)在1.8 kV、 25 和200 Q条件下电转化至大肠杆菌&/57 感受态细 胞，使rShuttle-AVP2与pAdEasyTM Vector发生同源重组，转化至DH5a宿主菌，挑选出阳性克隆，用 PCR、尸acl酶切(图3)鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，命名为pAd-AVP2。3) 重组病毒的获得
按照脂质体转染试剂操作方法，将预先用尸flcl线性化的重组质粒pAd-AVP2转染HEK-293A细 胞，5%C02， 37'C静置培养10d以上，显微镜观察细胞病变，当细胞病变达70%时，收毒。经3次噬 斑纯化实验，获得重组病毒(rAd-AVP2)的滴度为10112TCID5()/mL。
4) 病毒样粒子的生物学特征研究
① 间接免疫荧光
将重组腺病毒稀释后接种于长满单层的HEK-293A细胞，5%C02、 37'C培养，约24 h，弃去上清， 用PBS洗涤一次，37'C干燥45min， -20匸冷冻45 min，再以冷的无水乙醇4'C固定45 min， PBST洗 涤3次；加入50 nL 1:40稀释的猪抗PPV的血清，37。C作用1 h，用PBST洗涤3次；加入1:100 F1TC陽SPA， 37'C作用1 h，洗涤3次；显微镜观察。重组腺病毒rAd-AVP2对应孔(a)中呈现较强的荧光，而细胞 对照孔(b)没有荧光出现(图4)，说明重组腺病毒rAd-AVP2在细胞中表达了 PPV: AVP2蛋白。
② 蛋白质印记
用8。/。PEG-6000浓縮重组腺病毒HEK-293A细胞培养物，同时设定正常HEK-293A细胞培养物为 对照。将上述浓縮蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印到硝纤膜后，10%脱脂乳封闭过夜；加入1:40猪抗 PPV的血清室温作用2 h;洗涤3次，加入1:20000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG，室温作 用1.5 h;充分洗涤后，加入化学发光法显色液(DAB)，观察特异蛋白条带。浓縮的重组腺病毒经电 泳转印显色后显示，在66 KD处均有一条明显的条带，而对照正常的HEK-293A细胞没有(图5)， 说明重组腺病毒rAd-AVP2在细胞中表达了 PPV: AVP2蛋白。
③ 病毒样粒子的粗纯化与电镜观察
收集病变细胞，用PBS洗两次，1000 r/min 15 min离心，重悬于50 mmo1/1 NaHC03中，超声波裂 解后，24 000r/min离心5min，上清液中含有表达的嵌合蛋白。收集的上清中加入硫酸铵至终浓度20。/0， 4'C搅拌过夜进行沉淀，然后离20 000r/min离心10min ，沉淀重悬于中，透析除盐即为嵌合病毒样 粒子的粗提物。腺病毒野毒做同样处理后做对照。加入1:10稀释的猪抗PPV血清37'C作用lh后再 4'C过夜，以12 000r/min离心90min,沉淀重悬于少量水中，用3%的磷钩酸负染后经透射电镜观察。 在电镜下可以看到大量病毒样粒子存在，呈圆型，直径为30nm左右，其形态大小均与全病毒粒子相 似(图6)，说明重组腺病毒rAd-AVP2在细胞中表达的PPV:AVP2蛋白能自我组装成病毒样粒子。
红细胞凝集试验
参照《动物病毒学》，使用0.7。/。豚鼠红细胞的生理盐水悬液。重组腺病毒rAd-AVP2血凝效价为l:64， 空的腺病毒野毒没有血凝活性，说明rAd-AVP2表达的AVP2蛋白保持PPV原有的生物学活性。
2、以PPV VP2病毒样粒子作为一种抗原转运载体,构建表达2型猪圆环病毒Cap基因的重组PPV VP2病毒样粒子(图16)
1)获取ACap-AVP2目的基因并克隆入pMD19-T载体
以GenBank中PCV2-js2002基因登录号为AY691679和PPV VP2重组质粒的基因序列为模板， 用软件Primer 5.0设计引物P3， P4， P5， P6和P7，分别加入酶切位点，PCV2 js2002由本实验室 分离鉴定(公知公用，见参考文献潘群兴等，检测PCV2、 PPV、 PRV疫苗株与野毒株的多重PCR 方法，中国病毒学，2005， 20 (6) 603 60)。
P3 5' - ctggtaccatggtccaccgcccaggag - 3' Kpnl
P4 5'-cagctagccgttaccgctggagaagg-3' Nhel
P5 5'-gagctagcgggggggttggtgtgt-3' Nhel
P6 5' -cggctgcagctagtataa加cttgg -3' Pstl
P7 5'-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3' 油,I 以P3， P4引物扩增PCV2Cap蛋白的165-200位氨基酸基因108 bp (图7)的片段ACap，以P5，P6引物扩增PPV VP2蛋白C端1640 bp (图1)的片段AVP2，扩增的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上 电泳后，回收并将其与pMD19-T Vector连接，转化￡co//DH5a，碱裂解法提取质粒，分别用K/wI/满el 和^/^1/尸^1双酶切鉴定，获得阳性质粒(pTAC叩，pTAVP2)。
利用引物上的内切酶A%d和pMD19-T Vector上的尸wl将阳性质粒pTACap双酶切，回收2.8 Kb 的片段，同时利用引物上的内切酶Mzel和尸sfl将阳性质粒pTAVP2双酶切，回收1.64Kb的小片段， 然后将回收的两片段用T4DNAUgase连接，转化DH5a,碱裂解法提取质粒，^pwI/尸Wl双酶切 鉴定，阳性质粒命名为pTACap-AVP2。
2) 重组质粒pAd-ACap-AVP2的构建与鉴定
以P3， P7为引物，阳性质粒pTACap-AVP2为模板，PCR扩增ACap-AVP2片段，并引入内切 酶A:/wI/Mrfl。按照pAdEasy Vector载体系统操作说明，利用双酶切位点C^p"I/M rt)将外源片段 (ACap-AVP2)克隆至转移载体pShuttle-CMV中；用PCR、 /^"I/Afe/I双酶切及测序分析进行鉴定 (图8)，命名为rShuttle-ACap-AVP2。
用尸wel酶切该重组质粒，使其线性化，然后与pAdEasyTMVector在1.8kV、 25 和200 Q条件 下电转化至大肠杆菌^a/5JW感受态细胞，使rShuttle-ACap-AVP2与骨架载体(pAdEasy Vector) 发生同源重组，转化至DHsa宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、尸acl酶切鉴定重组是否正确(图9)， 构建成重组质粒，命名为pAd-ACap-AVP2。
3) 重组病毒的获得与纯化
按照脂质体转染试剂操作方法，将预先用线性化的重组质粒pAd-ACap-AVP2转染 HEK-293A细胞，5%C02， 37。C静置培养10 d以上，显微镜观察细胞病变，当细胞病变达70%时，收 毒。经3次噬斑纯化实验，获得重组病毒(rAd-AVP2)的滴度为10118TCID5()/mL。
4) 嵌合病毒样粒子的生物学特征研究
① 间接免疫荧光
将重组腺病毒稀释后接种于长满单层的HEK-293A细胞，5%C02、 37'C培养，约24 h，弃去上清， 用PBS洗涤一次，37'C干燥45min， -20°<:冷冻45 min，再以冷的无水乙醇4'C固定45 min, PBST洗涤 3次；分别加入50 nL 1:40稀释的猪抗PCV2血清(a)和猪抗PPV的血清(b)， 37。C作用1 h，用PBST洗 涤3次；加入1:100 FITC-SPA， 37。C作用lh，洗涤3次；显微镜观察。重组腺病毒rAd-ACap-AVP2 呈现较强的荧光，而细胞对照孔(c)没有荧光出现(图10)。说明重组腺病毒rAd-ACap-AVP2在细胞 中表达了 PPV: AVP2和PCV2: ACap蛋白。
② 蛋白质印记
用8。/。PEG-6000浓縮重组腺病毒HEK-293A细胞培养物，同时设定正常HEK-293A细胞培养物为 对照。将上述浓縮蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印到硝纤膜后，10%脱脂乳封闭过夜；加入1:40猪抗 PCV2血清和猪抗PPV的血清室温作用2h;洗涤3次，加入l:20000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊 抗猪IgG，室温作用1.5h;洗涤4次，加入化学发光法显色液(DAB)，观察特异蛋白条带。浓縮的重 组腺病毒经电泳转印显色后显示， 一抗为猪抗PPV血清或猪抗PCV2血清时，在66KD处均有一条明 显的条带，而对照正常的HEK-293A细胞没有(图11)，说明重组腺病毒在细胞中表达了ACap-AVP2 蛋白。
③ 嵌合病毒样粒子的粗纯化与电镜观察
收集病变细胞，用PBS洗两次，1000 r/min离心15 min，重悬于50 mmo1/1 NaHC03中，超声波 裂解后，24 000r/min离心15min，上清液中含有表达的嵌合蛋白。收集的上清中加入硫酸铵至终浓度 20%, 4°C搅拌过夜进行沉淀，然后离20 000 r/min离心10 min，沉淀重悬于中，透析除盐即为 嵌合病毒样粒子的粗提物。腺病毒野毒做同样处理后做对照。加入1:10稀释的猪抗PPV血清37°C作用1 h后再4'C过夜，以12 000 r/min离心90 min，沉淀重悬于少量水中，用3%的磷鸨酸 负染后经透射电镜观察。在电镜下可以看到大量病毒样粒子存在，呈圆型，直径为30nm左右，其形 态大小均与全病毒粒子相似(图12)，说明重组腺病毒rAd-ACap-AVP2在细胞中表达的ACap-AVP2 蛋白能自我组装成病毒样粒子。
红细胞凝集试验
参照《动物病毒学》，使用0.7%豚鼠红细胞的生理盐水悬液。重组腺病rAd-ACap-AVP2 血凝效价为1:64，空的腺病毒野毒没有血凝活性，说明rAd-ACap-AVP2表达ACap-AVP2蛋白保持PPV
原有的生物学活性。
5)小鼠免疫实验
① 免疫程序
6-8周龄的雄性小鼠60只，随机分为2组，每组30只。第一组背部皮下多点注射101()TCID50 重组腺病毒rAd-ACap-AVP2;第二组每只小鼠皮下注射101Q TCID5fl重组腺病毒rAd-Cap;第三组每 只小鼠皮下注射IO1。 TCID5。没有外源基因的空的腺病毒作为阴性对照；第四组每只小鼠皮下注射适量 的PBS作对照；两周后进行相同的免疫。分别在首免、首免后14， 28， 35， 42， 49和56天，采集血 清测定PCV2抗体及PPV/PCV中和抗体。首免后28， 42和56天，每组宰杀3只小鼠，取其脾脏，分 离淋巴细胞，测定淋巴增殖能力。
② ELISA抗体的检测
PCV2 0RF2原核表达产物(本实验室制备)经His-band纯化试剂盒纯化，测定蛋白的平均浓度 为1.10mg/mL。由ELISA方阵试验可以得出，当抗原包被浓度为1.8 ng/mL，抗体稀释100倍， 一抗 37'C分别孵育1.5h，酶标二抗37r孵育45min，加TMB-H202 (四甲基联苯胺-过氧化氢)溶液显色， 37'C反应10-15 min。加2MH2S04溶液，终止反应，50nL/孔。反应条件比较合适，此时P/N值较大， 且f月性血，的pD值较小，即非特异性比较/J二。结,判^_: Pi-N^XH5时实，有效。(样品OD值-Ni)/(P^-Ni)20.45阳性；(样品OD值-Ni)/(P^-N^〈0.45阴性。其中pi表示阳性对照平均 值；N 表示阴性对照平均值。
间接ELISA抗体检测结果rAd-ACap-AVP2免疫组小鼠在首免后第14天能检测到PCV2特异性 抗体，抗体的滴度随着时间的延长而增高，在二免后35天时ELISA杭体水平达最高为1:10000，明显 高于rAd-Cap免疫组；而空的腺病毒和PBS免疫组小鼠没有产生PCV2特异性抗体(图13)，说明表达
嵌合病毒样粒子的重组腺病毒具有良好的免疫原性，免疫动物后可诱导产生特异性免疫保护反应。
③ 中和抗体的检测
用IFA检测PCV2的中和抗体。具体方法如下小鼠血清56。C灭活30 min， 12000 r/min离心10 min， 取上清，用含2。/。FCS的1640培养基按1:4， 1:8， 1:16， 1:32和1:64倍比稀释病毒PCV2被稀释为 2000 TCID5。/mL;上述血清和病毒的稀释液各取50 ^L,混合均匀，37。C水浴1 h;取出后加入已长满 细胞单层的PK-15细胞，每孔100pL，每个血清稀释度接种四孔，同时设定只接种病毒PCV2的阳性 对照孔和正常细胞阴性对照孔，37t静置培养72h。按常规方法进行IFA实验，以减少70%或更多荧 光的血清最高稀释度的倒数为中和抗体滴度。在IFA中，所有阳性对照细胞均出现明显的荧光，阴性 对照无荧光，而加入免疫小鼠血清的孔没有或仅有微弱的荧光。同一组在不同时间中和抗体滴度不同， 首免后14天所有小鼠中和抗体滴度均<4，到二免后35天rAd-ACap-AVP2免疫组的中和抗体平均滴 度为16，高于rAd-Cap免疫组(12);空的腺病毒和PBS免疫组中和抗体滴度几乎为0。
用TCID5Q降低试验测定PPV的中和抗体。具体方法如下小鼠血清56'C灭活30 min, 12000 r/min 离心10min，取上清，用含2。/。FCS的1640培养基按1:4, 1:8， 1:16， 1:32和1:64倍比稀释;病毒PPV 被稀释为2000TCID5o/mL;上述不同稀释度的血清和病毒的稀释液等体积混合，37'C水浴1 h;取出接 种40 50%融合的PK-15细胞，每孔100 nL,每个血清稀释度接种4孔，同时设定只接种病毒的PK-15 阳性对照孔和正常细胞阴性对照孔。37'C静置培养4-5天；显微镜观察。能100%抑制病变的血清最高 稀释度的倒数为中和抗体滴度。所有阳性对照细胞均出现明显的细胞病变，阴性对照细胞均没有出现细胞病变rAd-ACap-AVP2免疫组PPV中和抗体滴度判定为20。rAd-Cap免疫组，空的腺病毒组和PBS 对照组中和抗体滴度几乎为0。
④淋巴细胞转化试验
宰杀小鼠，无菌取其脾脏，剥离结缔组织，置于无菌平皿中加入少量的无菌PBS，用针头刺脾 脏，然后用弯针头挤压，挤出其中的细胞；用弯针头研磨均匀，弃去多余的结缔组织和大的组织块； 在10mL的离心管中加入6mL的淋巴细胞分离液，再轻轻地加入研磨地组织匀浆液；2000 r/min离心 15 min:取中间云雾状的白色细胞层，置于新的离心管中，加入适量的Hank'液；2000 r/min离心1 0 min; 弃上清，加入适量的含10%FCS的1640营养液重悬细胞，然后进行细胞计数；根据计数结果将细胞浓 度调整为5 x 106/mL，加入96孔细胞板中，每孔100 细胞悬液，每只小鼠铺12孔；其中4孔加入 终浓度为20 pg4iL的ConA，另4孔加入终浓度为15 ng/pL的LPS，其余4孔作为阴性对照；37°C， 5%C02静置培养44 h;每孔加入20 nL MTT(浓度5 mg/mL),培养4 h;弃去上清，每孔加入100 DMSO， 使结晶溶解，振荡；测定OD57。nm，计算ConA刺激孔地平均OD57Qnm/未刺激孔的平均OD57。nm ( SI 值)。用t检验法检验免疫组和对照组的SI值差异是否显著。二免后14天，四组的刺激指数(SI)接近， 从第二次免疫后28天到42天rAd-ACap-AVP2免疫组的SI值迅速升高，而Wild Ad和对照组的SI 值变化不大，经t检验分析二免后28至42天免疫组和对照组的SI值差异极显著((PO.Ol)，说明重组 腺病毒rAd-ACap-AVP2能增强小鼠细胞免疫(图14)。
本发明构建的重组腺病毒表达的嵌合病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]，具有良好的免疫原性，免 疫动物后可诱导产生保护性免疫反应。嵌合病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]作为一种蛋白质载体多价重组 疫苗不但安全性高、价廉，而且可以有效的预防PCV2感染及由PCV2与PPV混合感染而导致的PMWS 的发生，是一种新型的安全有效的后选疫苗。序列表
<110>江苏省农业科学院
〈120〉表达外源基因的重组猪细小病毒VP2病毒样粒子
<130>说明书
<140> 00
<141> 2008-03-25
〈160〉 7
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211〉 24
<212〉 腿
<213>人工合成
<220〉
<221> 引物P1
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gaggtaccgg gggggttggt gtgt 24
<210〉 2
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<212〉 醒 〈213〉人工合成 〈220〉
<221〉 引物P2
<222〉 (1). . (29)
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cgggcggccg cctagtataa ttttcttgg 29
<210> 3
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<212〉 D贴 〈213〉人工合成 〈220〉
〈221〉 引物P3
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<212〉 醒
<213〉人工合成
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<222〉 (1),.(24) <223〉
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gagctagcgg gggggttggt gtgt 24
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<212〉 腿
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cgggcggccg cctagtataa ttttcttgg 29
权利要求
1、表达外源基因的重组猪细小病毒(PPV)VP2病毒样粒子，其特征在于，是利用腺病毒表达系统表达PPV VP2C端1640bp基因片段ΔVP2而构建成的重组PPV VP2病毒样粒子。
2、 根据权利要求1所述的重组病毒样粒子，其特征在于，是由以下方法构建而成的1) 获取AVP2目的基因并克隆入pMD19-T载体以GenBank中NADL-2基因登录号为NC:001718基因序列为模板，用软件Primer 5.0设计引物 P1 5 '-gaggtacc鹏ggggttggtgtgt-3' P2 5 '-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3'分别加入《/wl禾口 Wo/I酶切位点，以P1， P2引物扩增PPV弱毒株NADL-2的DNA，扩增含VP2 基因1740 bp中的C端1640 bp片段AVP2，扩增的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后，回收并将其 与pMD19-T Vector连接，转化￡.co//DH5a，碱裂解法提取质粒，K/wI和Mwl双酶切鉴定，获得阳性 质粒pTAVP2;2) 重组质粒pAd-AVP2的构建与鉴定利用双酶切位点A^/IMfe/I将目的片段克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中；用A^"IM/oH双酶切及 测序分析进行鉴定，命名为rShuttle-厶VP2;用Pme I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与pAdEasy TMVector在1.8 kV、 25 和200 Q条件下电转化至大肠杆菌A/5/W感受态细胞，使rShuttle-AVP2 与pAdEasy Vector发生同源重组，转化至DH5(x宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR，尸czcl酶切鉴定 重组是否正确，构建成重组质粒，命名为pAd-AVP2。3) 重组PPV VP2病毒样粒子的获得将重组质粒pAd-AVP2转染转染HEK-293A细胞，获得重组腺病毒pAd-AVP2，重组腺病毒表达 的AVP2蛋白在该重组腺病毒感染的HEK-293A细胞中自我装配成病毒样粒子PPV:VLPs，即为构建 的在腺病毒表达系统中表达外源基因的重组PPV VP2病毒样粒子。
3、 权利要求1或2所述表达外源基因的重组PPV VP2病毒样粒子作为抗原转运载体的应用所获 得的产品。
4、 根据权利要求3所述重组PPV VP2病毒样粒子作为抗原转运载体的应用所获得的产品，其特 征在于，将表达2型猪圆环病毒PCV2 Cap的165-200位氨基酸基因ACap嵌合在权利要求1或2所述 PPVVP2病毒样粒子AVP2的N端，然后克隆到腺病毒表达系统中所获得的病毒样粒子或疫苗产品。
全文摘要
本发明涉及表达外源基因的重组猪细小病毒(PPV)VP2病毒样粒子的构建及应用，属于基因工程疫苗领域。将PPV VP2基因的C端基因片段克隆于人5型腺病毒穿梭载体，获得重组腺病毒rAd-ΔVP2，ΔVP2蛋白成功的高效表达，并能自我装配成病毒样粒子[PPV:VLPs]。以PPV VP2病毒样粒子作为抗原转运载体，将2型猪圆环病毒核衣壳蛋白(Cap)基因嵌合在PPV VP2基因的N端，获得重组腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2。嵌合的VP2(ΔCap-ΔVP2)蛋白成功的高效表达，并能自我装配成病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]。本发明还涉及该重组病毒及其表达外源基因的重组PPV VP2病毒样粒子在疫苗免疫等方面的应用。
文档编号C12N15/861GK101289657SQ20081002464
公开日2008年10月22日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日 公开号200810024643.发明者何孔旺, 俞正玉, 倪艳秀, 吕立新, 张雪寒, 温立斌, 潘群兴, 琦 肖, 茅爱华, 郭容利, 黄克和 申请人:江苏省农业科学院 被以下专利引用 (4),