组成型高表达强启动印度芥菜BjCET1启动子及应用的制作方法

本发明涉及植物转基因工程领域，具体地，组成型高表达强启动印度芥菜BjCET1启动子及应用。
背景技术：
：在植物宿主中外源基因的表达是通过连接到特定的启动子下游实现的，因此，选择什么类型的启动子便决定了外源基因在植物体内表达的时空分布。启动子类型通常分为组成型、组织特异型和诱导型三大类，在植物转基因研究中，由于组成型启动子表达持久、高效和稳定，在应用上最为广泛,目前常用的有CaMV35S启动子、玉米Ubiquitin-1启动子和水稻的Actin1启动子等。植物重金属超富集植物是自然界中发现的比普通植物能在植物体内累积100-1000倍以上的一类植物，在利用植物修复技术清除污染的土壤和水体方面具有巨大的研究和应用价值。经过近几年的研究发现，其中CDF/CE(cationdiffusionfaciliator/cation-efflux)家族金属跨膜转运蛋白成员的持续高水平表达发挥了重要作用(Milneretal，2012；Langetal，2011；Persansetal，2001)。该家族基因在提高普通植物重金属耐性和累积量的有效性已有研究报道(Vanderzaaletal,1999；Langetal，2011；)，然而有关其中启动子的研究还少有报道。研究和利用植物本身来源的强启动子来提高目的蛋白在植物体内的高效、稳定表达，增强转基因生物安全，对于构建人工重金属超富集植物和植物转基因研究具有重要的科学意义和应用价值。印度芥菜(BrassicajunceaL.)对多种重金属离子(如Zn、Cd、Co、Ni、Pb、Cs等)具有超富集能力，是植物修复技术的主要模式植物之一。开发和利用植物本身的高强度启动子对于增强转基因植物修复污染土壤的效率显得尤为必要。本发明从印度芥菜中克隆了其CDF/CE家族蛋白基因BjCET1的启动子，命名为BjCET1P。通过实验分析，发现BjCET1P启动子自翻译起始位点ATG往上-1000bp和-2000bp的启动子片段均呈现出很强的组成型表达特性。在正常培养条件下，BjCET1P转基因拟南芥中，其所驱动的GUS报告基因在根、茎、叶和花等器官中都表现出很强的表达水平，高出对照CaMV35S启动子约15倍左右，并且GUS表达水平稳定，几乎不受环境因子诱导。这些数据充分表明BjCET1P为一个很强的组成型表达启动子，可用于植物高效表达载体的构建。目前为止，还没有关于BjCET1P强启动子的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供组成型高表达强启动印度芥菜BjCET1启动子及应用。本发明从印度芥菜中克隆获得了一个新的组成型强启动子，构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，自起始密码起-2000bp调控区的启动子驱动的GUS基因在转基因植株的根、茎、叶、花中均能高效表达。该启动子是通过染色体步移技术获得BjCET1基因5′端上游约2000bp序列，经转录起始位点分析发现，印度芥菜BjCET1基因转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-83nt处，该序列除包含启动子中心元件TATABOX和CAAT-box，还包含多种功能元件，如高效转录元件(5'UTRPy-richstretch)、光应答元件(Box-4G-BoxGA-motif)、厌氧应答元件(ARE)、分生组织表达应答元件(CAT-box)、脱落酸应答元件(ABRE)、生长素应答元件(TGA-element)、抗旱应答元件(MBS)、低温应答元件(LTR)和防御和胁迫应答元件(TC-richrepeats)。为了完成该启动子的初步功能分析，本发明以pBI121为出发载体构建了含有上述印度芥菜BjCET1P组成型基因启动子驱动的GUS基因植物表达载体，即用印度芥菜BjCET1P基因启动子片段替代pBI121中驱动GUS基因表达的35S启动子，获得的植物表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，待拟南芥繁殖开花时，配制浸染液，用农杆菌浸染将要开放的花序。本发明分别取转基因拟南芥的根、茎、叶、花和种胚，通过现有的方法检测GUS基因的表达情况。本发明所提供的启动子区域，可驱动GUS基因在根、茎、叶、花和种胚中高效表达。由此可见本发明克隆的印度芥菜BjCET1P基因的启动子为组成型表达特性。通过上述实验证实了，在本发明提出上游-1000bp区段即具有高效组成型表达特性，可以应用在植物遗传工程，构建该启动子和相关基因的表达载体，通过转基因手段定向改变植物性状，如增强植物耐受生物或非生物胁迫能力、提高农作物营养品质等，特别是对于提高植物重金属超富集和超耐受性方面发挥关键作用。此外，该启动子的克隆对植物转基因
技术领域：
强启动子的研究也具有重要意义。附图说明图1为BjCET1基因5’端上游序列扩增的电泳图。设计优化3条用于获得基因5'端未知序列的嵌套SP反向引物SP1、SP2和SP3。以印度芥菜基因组DNA为模板，以GenomeWalkingKit(TaKaRa)提供的AP2兼并引物为上游引物，嵌套SP反向引物为下游引物进行TAIL-PCR。1.DNAMaker；2.第一轮PCR反应产物；3.第二轮PCR反应产物；4.第三轮PCR反应产物。图2为BjCET1P启动子序列与GUS基因融合表达的载体构建流程图。利用限制性内切酶BamHI和HindIII，通过T4DNA连接酶，把植物表达载体pBI121-GUS上的35S启动子片段替换为克隆载体上的BjCET1P启动子片段，构建成pBI121-BjCET1P-GUS植物表达载体。图3为pBI121-BjCET1P-GUS融合表达载体转化拟南芥的DNA检测图。以提取的融合表达载体转化的拟南芥基因组DNA为模板，上游引物为基因特异性引物(BjCET1P1转基因植株的上游检测引物为Bj121LF：AAGCTTGCGGACAGAACCAGTTTATTCAGTCC，BjCET1P2转基因植株的上游检测引物为Bj121SF：AAGCTTGTAGTACTAGTAAATGATTTGGA，pBI121载体转基因植株检测引物为pBI121F：ACTATCCTTCGCAAGACCC)，下游引物为pBI121载体通用引物35-GUS-AR：CCTGCCCAACCTTTCGGTAT。1，BjCET1P1阳性植株PCR检测结果；2，BjCET1P2阳性植株PCR检测结果；3，pBI121阳性植株PCR检测结果。图4为pBI121-BjCET1P-GUS转基因拟南芥的GUS染色图，包括在正常培养条件和各种胁迫条件下，在根、茎、叶等组织部位的染色情况。图5为图4中不同基因型在不同环境条件下GUS染色的光密度统计分析。1是不同基因型的拟南芥在蒸馏水中培养的GUS染色结果；2是不同基因型的拟南芥在MS液体培养基中培养的GUS染色结果；3是不同基因型的拟南芥在MS固体培养基中培养的GUS染色结果。ttest，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。具体实施方式实施例1BjCET1启动子序列的获得1.植物材料的准备印度芥菜的种子用0.1％升汞浸泡8分钟，用双蒸水洗涤4遍，每遍洗涤5分钟，将种子放入含有MS培养基的三角瓶中。培养条件：25℃，16h光照/8h黑暗培养。20天后，收获幼苗。2.提取印度芥菜基因组DNA3.利用Genomewalking技术扩增BjCET1基因的启动子序列1)根据genomewalking试剂盒(KATARA,货号为D316)说明书要求，分别设计优化三条同向且退火温度较高的特异性引物，分别命名为SP1(5′-TACCAGTGAGGAGCCAAATGAGC-3′)，SP2(5′-GAGAGGAGATGCGCTGCGTCG-3′)，SP3(5′-GGCATTGCGTTCTTGGGCGTC-3′)。2)取1μg基因组DNA为模板，用试剂盒中提供的AP2和上述SP1分别为上游引物和下游引物，按照下列程序进行第一轮PCR反应。第一轮PCR反应条件为：94℃1min；98℃1min；94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30s，25℃退火3min，72℃延伸2min，1个循环；94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸2min，94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸2min，94℃变性30s，44℃退火1min，72℃延伸2min，15个循环；72℃延伸10min。3)将第一轮PCR反应液稀释10倍后，取1μl作为第二轮PCR反应液的模板，以试剂盒中提供的AP2为上游引物，SP2为下游引物进行第二轮PCR反应。2ndPCR反应条件为：94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸2min，94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸2min，94℃变性30s，44℃退火1min，72℃延伸2min，15个循环；72℃延伸10min。3)将第二轮PCR反应液稀释10倍后，取1μl作为第三轮PCR反应液的模板，以试剂盒中AP2为上游引物，SP3为下游引物进行第三轮PCR反应。3rdPCR反应条件为：94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸2min，94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸2min，94℃变性30s，44℃退火1min，72℃延伸2min，15个循环；72℃延伸10min。实施例2植物表达载体构建与转化2.1BjCET1P启动子与GUS报告基因融合植物表达载体的构建获得约2000bp的BjCET1的启动子(BjCET1P)序列(SEQNo:1)后，对其进行序列分析，确定了BjCET1P中两个发挥功能的片段：1724bp(SEQNo:2)，1039bp(SEQNo:3)，分别命名为BjCET1P1和BjCET1P2。以印度芥菜的基因组DNA为模板，设计特异引物(BjCET1P1F：5′-AAGCTTGCGGACAGAACCAGTTTATTCAGTCC-3′，BjCET1P1R：5′-GGATCCCTGATAAAATAAAAATAAAAGGGGGT-3′；BjCET1P2F：5′-AAGCTTGTAGTACTAGTAAATGATTTGGA-3′，BjCET1P2R：5′-GGATCCCTGATAAAATAAAAATAAAAGGGGGT-3′)扩增出BjCET1P1和BjCET1P2片段。将扩增得到的2种目的片段BjCET1P1、BjCET1P2与pMD19-T载体连接。获得阳性克隆后，提取质粒，并对质粒用限制性内切酶HindIII、BamHI进行双酶切。再将酶切后回收的目的片段与同样经过HindIII/BamHI酶切的pBI121载体，借助T4DNA连接酶进行连接，构建了2种植物表达载体pBI121-BjCET1P1和pBI121-BjCET1P2。在pBI121-BjCET1P1中，植物表达载体pBI121的启动子35S被BjCET1P中起始密码子上游的1736bp片段所取代；pBI121-BjCET1P2中，植物表达载体pBI121的启动子35S被BjCET1P中起始密码子上游的1051bp片段所取代。将构建好的载体质粒转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，并鉴定阳性克隆。提取阳性克隆的质粒后，取1μl加入100μl农杆菌C58感受态细胞中，轻弹混匀。将全部感受态细胞加入电转杯中弹平，电击。随后立即加入600μlYEB液体培养基于电转杯中吸打混匀。然后，将全部培养基转移到5ml离心管中，150rpm，28℃摇菌2h。再取20μl转化菌液接种在含Kan(50μg/ml)、Rif(50μg/ml)的YEB固体培养基上，28℃倒置暗培养过夜。再进行克隆鉴定，挑选出电击转化成功的农杆菌克隆。BjCET1P核苷酸序列SEQNo:1：BjCET1P1核苷酸序列SEQNo:2：GCGGACAGAACCAGTTTATTCAGTCCGGGAAGCAAGAATCTCTCTTTCCAGTAGAATCAAACCGCCTGAAGGCAAGCAAGGAAGTGGAAGTTGGTTGTCAGAGCACCAACGAGGGGACAGTAACAGCAGGAGGACAAAGTAGGAGCAGCGGCACAAGAGAGAAAGCAAAGGAGGAAGAAGAAGAAGGTGAAGGTGGTGTCACTGCCCAGCAACGCAAGAGTGAGAGAGAAGCTGCGCTGATGAAGTTCCGGATGAAGAAGAAAGATCGATGCTTTGGTAAAAAGGTAAGATATGAGAGCAGGAAGAAGCTAGCAGAGCAGCGTCCAAGAGTGAAAGGCCAGTTTGTGCGTGCTGTAAACTCAGATGCGTCTATTACTAAATAATGCCTCGCAGCCCAACGAGAGAAGTTTCCACACGGTGAAAGGCCCAGTTATAGAGAGACTCGTTGTAATATCAAGTGTGGCTTATTTTGTATTTGAGTGTTATTTTCTCAGCTAATCTTATTAGAATATTGGGGTAACTATTCCACTTACTATTAGATAGATCATCTCTATTATCTGCGAATGATCAAAGCTACGTTAAACCGTAACCCCAGATTTTCTGCAAGTTTTTTTTTTCCATATTGACTTGGCATTTAATGTAAGAGGACTATCAGTATTATCTTCTTCTTTTTTTCACTTAAATGGTAGTACTAGTAAATGATTTGGACATTATTTTCTTTGTGATTCAATTCAATGTATCCAAATATTTTTCCAATTTTGTATTTATTCTACTTTTACAATTTGTTTTCTTCTTCTCAAAACTGTGAACCAATAAAATTATTTCATTTAAAGCCGTGGAAAACCACTGAAAAGGCCCAATCATTTGAGAGTAAACCAGGTAATTAAAGCCCCAATCATTCGGTTGGATTAGTAAAGTAGTGCCAGAAAGACAGGAGAGCAATAATTACGGTGAATAAGTAGAGTGGCGATGCCACGTGTATATAAAATTGACCGTGGAAAAGACACAACAAGAAAACAAAACCATAGAGAATAGAGATCTGTAAAGGAGGAGTACAAGGATAAGAGAGAGAAAAAAAGAAAAAAAGGACCCCGGAAAGAAAAGGAAAAGAGAAGCTGCCCCCATCTCATCTCTCGTGGCCGCCTCATACTTTTCTATTCATAAATAAAAGGCTTCTTCCTTTTTCCTCGACATTCTTTAAAGGGCTAGGAGGAGTAGTGAATCTATCAAACCGGCAACTTCAGCCTCTCGACTCTCTTCTCTCTCTCTGGTTAGTTCTTTTCTTTTTTAAGTTTTGTACGCTCTGTGTTTGCTACCTTTATTATTATTATTATTATTCGTGTCGAAGTTGAAGAATCAGTCTTTTTTTGCCGATGCATCTCTGTAGCTGTATACTATATCTGTTACAGTGTTTCTAGATTCTTCATTGTCACATCTGGAATTGGTCTGATTTTGACTCTTTCATACTTTTAATTAATTATTATAATGATTAGTCTGTTAATATTATTATATCGTATCTATGTGTTTGTGCTAGTAGAACCTCCTCCTGTACAGGACTAGTTGTGCGATCCATGTCTGATTTGTTCTTTTTTAGATTATAAAGTTGCTTTCTTTTTCTTTTTGCTTCAAACAGGTTTACCCAATTTCGGACAACTATATAGCTCCCTTCTTGTTCTTGTTCTTGTCTCATTCTTGCTTACCCCCTTTTATTTTTATTTTATCAGBjCET1P2核苷酸序列SEQNo:3：GTAGTACTAGTAAATGATTTGGACATTATTTTCTTTGTGATTCAATTCAATGTATCCAAATATTTTTCCAATTTTGTATTTATTCTACTTTTACAATTTGTTTTCTTCTTCTCAAAACTGTGAACCAATAAAATTATTTCATTTAAAGCCGTGGAAAACCACTGAAAAGGCCCAATCATTTGAGAGTAAACCAGGTAATTAAAGCCCCAATCATTCGGTTGGATTAGTAAAGTAGTGCCAGAAAGACAGGAGAGCAATAATTACGGTGAATAAGTAGAGTGGCGATGCCACGTGTATATAAAATTGACCGTGGAAAAGACACAACAAGAAAACAAAACCATAGAGAATAGAGATCTGTAAAGGAGGAGTACAAGGATAAGAGAGAGAAAAAAAGAAAAAAAGGACCCCGGAAAGAAAAGGAAAAGAGAAGCTGCCCCCATCTCATCTCTCGTGGCCGCCTCATACTTTTCTATTCATAAATAAAAGGCTTCTTCCTTTTTCCTCGACATTCTTTAAAGGGCTAGGAGGAGTAGTGAATCTATCAAACCGGCAACTTCAGCCTCTCGACTCTCTTCTCTCTCTCTGGTTAGTTCTTTTCTTTTTTAAGTTTTGTACGCTCTGTGTTTGCTACCTTTATTATTATTATTATTATTCGTGTCGAAGTTGAAGAATCAGTCTTTTTTTGCCGATGCATCTCTGTAGCTGTATACTATATCTGTTACAGTGTTTCTAGATTCTTCATTGTCACATCTGGAATTGGTCTGATTTTGACTCTTTCATACTTTTAATTAATTATTATAATGATTAGTCTGTTAATATTATTATATCGTATCTATGTGTTTGTGCTAGTAGAACCTCCTCCTGTACAGGACTAGTTGTGCGATCCATGTCTGATTTGTTCTTTTTTAGATTATAAAGTTGCTTTCTTTTTCTTTTTGCTTCAAACAGGTTTACCCAATTTCGGACAACTATATAGCTCCCTTCTTGTTCTTGTTCTTGTCTCATTCTTGCTTACCCCCTTTTATTTTTATTTTATCAG2.2农杆菌浸染法转化拟南芥取100ml含有融合表达载体的农杆菌菌液于4℃，5000rpm，离心15分钟。再用侵染液稀释菌体至OD600＝0.6。然后将侵染液倒入托盘中，将事先剪去角果的拟南芥的花序在菌液中浸泡5min。将拟南芥头对头放置在托盘中，铺两层喷湿的卫生纸，盖上保鲜膜，套上黑色塑料袋，放在阴暗处24h。将拟南芥恢复原来直立的状态正常培养至开花结种。收集种子(T0代)于1.5ml离心管中，加入硅胶颗粒避光干燥1周。2.3转基因拟南芥鉴定及纯合种子的获得将2.2中收集的拟南芥种子用75％的酒精消毒后，铺在含有Kan(50μg/ml)抗生素的MS植物培养基上，于4℃避光春化处理3d，随后转入25℃培养箱中培养(16h光照:8h黑暗)约3周。将成功长出不少于3片叶子的拟南芥幼苗移栽土中培养约3周。分别剪取各拟南芥植株的1片叶子于1.5ml离心管中，提取叶片基因组DNA，并以此基因组DNA为模板进行阳性植株鉴定(图3)。将鉴定出的阳性植株继续培养至开花结种。分别收集各植株的种子(T1代)进行干燥处理1周。随后采用相同的方法进行种子培养、移栽及阳性植株鉴定，收集此代阳性植株种子(T2代)。以此方法继续筛选种子及鉴定阳性植株，直至收集到T3代种子即可认为获得纯和种子。以下为拟南芥阳性植株鉴定方法：根据PCR的要求，基因组DNA经浓度测定准确定量后，将其稀释至100ng/μl然后取1μl的稀释后的基因组DNA作为模版。配制25μl体系的pBI121-BjCET1P1植株基因组DNAPCR扩增反应液、pBI121-BjCET1P2植株基因组DNAPCR扩增反应液和pBI121空载体转化植株基因组DNAPCR扩增反应液。取PCR扩增反应产物5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，观察是否有目的条带。实施例3GUS染色鉴定BjCET1P启动子在拟南芥在根茎叶等组织部位和非生物胁迫条件下的启动下游基因表达情况分析取筛选至T3代的转基因种子，将野生型和转基因型分别接种至MS固体培养基和MS+Kana固体培养基平板上。避光，4℃春化3天后，置于25℃，16h光照，8h黑暗的培养箱中培养5天，取培养5天后的拟南芥幼苗进行后续处理实验。处理方式如下表所示：步骤1(移至6孔板，5ml/孔)步骤2(移至6孔板，5ml/孔)H2O处理(H)蒸馏水，48h蒸馏水，24h对照(C1)MS液体培养基，48hMS液体培养基，24h对照(C2)MS固体培养基，48hMS固体培养基，24hZn+MS液体培养基，48h含1000μMZnSO4的MS液体培养基，24hZn-MS液体培养基，48h去ZnSO4的MS液体培养基，24hFe+MS液体培养基，48h含1000μMFeSO4的MS液体培养基，24hFe-MS液体培养基，48h去FeSO4的MS液体培养基，24hNi+MS液体培养基，48h含500μMNiSO4的MS液体培养基，24hCd+MS液体培养基，48h含20μMCdCl2的MS液体培养基，24h然后，取处理的拟南芥幼苗置于1.5ml的离心管中，加入强GUS染色液。在真空泵中抽真空10min后，置于37℃染色12h，用75％的酒精脱色至阴性对照呈白色，拍照。图4为正常培养条件和各种胁迫条件下，不同转基因植株在根、茎、叶等组织部位的染色情况。从图中可见野生型拟南芥幼苗(WT)根、茎、叶均无染色，而表达GUS蛋白的转基因幼苗均有染色，说明本实验染色液对GUS蛋白酶具有很好的专一性。但是，无论在正常培养条件(蒸馏水、MS固体培养基、MS液体培养基)，还是金属离子胁迫条件下(MS液体培养基中加Zn减Zn，加Fe减Fe，加Ni，加Cd)转空载体CaMV35S启动子驱动的表达GUS的转基因幼苗其GUS染色显著弱于BjCET1P1和BjCET1P2启动子片段驱动的表达GUS的转基因幼苗染色。GUS染色的深浅反映了驱动其表达的启动子的驱动强弱程度，图5是利用ImageJ软件对在蒸馏水、MS液体培养基、MS固体培养基培养条件下不同基因型幼苗GUS染色的光密度进行了统计分析，可见BjCET1P1和BjCET1P2启动子强度相对于CaMV35S启动子达到显著或极显著水平，所驱动的GUS报告基因在根、茎、叶等器官中都表现出很强的表达水平，比对照CaMV35S启动子强度可高达约15倍左右。<110>河北农业大学<120>组成型高表达强启动印度芥菜BjCET1启动子及应用<160>3<210>1<211>2016<212>DNA<213>印度芥菜<400>1ggctgtagaggcaaggtgttcaggtggagcccaagacaccaagcggaatcacatgaaaag60ttgttcagatgtgatcacggaagcgctacaacgagcagcaaccatgagaacattggttca120tcaagcgtaagcggacagaaccagtttattcagtccgggaagcaagaatctctctttcca180gtagaatcaaaccgcctgaaggcaagcaaggaagtggaagttggttgtcagagcaccaac240gaggggacagtaacagcaggaggacaaagtaggagcagcggcacaagagagaaagcaaag300gaggaagaagaagaaggtgaaggtggtgtcactgcccagcaacgcaagagtgagagagaa360gctgcgctgatgaagttccggatgaagaagaaagatcgatgctttggtaaaaaggtaaga420tatgagagcaggaagaagctagcagagcagcgtccaagagtgaaaggccagtttgtgcgt480gctgtaaactcagatgcgtctattactaaataatgcctcgcagcccaacgagagaagttt540ccacacggtgaaaggcccagttatagagagactcgttgtaatatcaagtgtggcttattt600tgtatttgagtgttattttctcagctaatcttattagaatattggggtaactattccact660tactattagatagatcatctctattatctgcgaatgatcaaagctacgttaaaccgtaac720cccagattttctgcaagttttttttttccatattgacttggcatttaatgtaagaggact780atcagtattatcttcttctttttttcacttaaatggtagtactagtaaatgatttggaca840ttattttctttgtgattcaattcaatgtatccaaatatttttccaattttgtatttattc900tacttttacaatttgttttcttcttctcaaaactgtgaaccaataaaattatttcattta960aagccgtggaaaaccactgaaaaggcccaatcatttgagagtaaaccaggtaattaaagc1020cccaatcattcggttggattagtaaagtagtgccagaaagacaggagagcaataattacg1080gtgaataagtagagtggcgatgccacgtgtatataaaattgaccgtggaaaagacacaac1140aagaaaacaaaaccatagagaatagagatctgtaaaggaggagtacaaggataagagaga1200gaaaaaaagaaaaaaaggaccccggaaagaaaaggaaaagagaagctgcccccatctcat1260ctctcgtggccgcctcatacttttctattcataaataaaaggcttcttcctttttcctcg1320acattctttaaagggctaggaggagtagtgaatctatcaaaccggcaacttcagcctctc1380gactctcttctctctctctggttagttcttttcttttttaagttttgtacgctctgtgtt1440tgctacctttattattattattattattcgtgtcgaagttgaagaatcagtctttttttg1500ccgatgcatctctgtagctgtatactatatctgttacagtgtttctagattcttcattgt1560cacatctggaattggtctgattttgactctttcatacttttaattaattattataatgat1620tagtctgttaatattattatatcgtatctatgtgtttgtgctagtagaacctcctcctgt1680acaggactagttgtgcgatccatgtctgatttgttcttttttagattataaagttgcttt1740ctttttctttttgcttcaaacaggtttacccaatttcggacaactatatagctcccttct1800tgttcttgttcttgtctcattcttgcttacccccttttatttttattttatcagatggcg1860tcttcaagccccaaacattgccacatcatcgaggtcaatcgaggtaaatccgttgaagaa1920agcacaataattctggcaagcaaagcctgcggagaagccccctgcggcttctcagatctc1980aacaacgcttccggtgacgcccaagaacgcaatgcc2016<210>2<211>1724<212>DNA<213>印度芥菜<400>2gcggacagaaccagtttattcagtccgggaagcaagaatctctctttccagtagaatcaa60accgcctgaaggcaagcaaggaagtggaagttggttgtcagagcaccaacgaggggacag120taacagcaggaggacaaagtaggagcagcggcacaagagagaaagcaaaggaggaagaag180aagaaggtgaaggtggtgtcactgcccagcaacgcaagagtgagagagaagctgcgctga240tgaagttccggatgaagaagaaagatcgatgctttggtaaaaaggtaagatatgagagca300ggaagaagctagcagagcagcgtccaagagtgaaaggccagtttgtgcgtgctgtaaact360cagatgcgtctattactaaataatgcctcgcagcccaacgagagaagtttccacacggtg420aaaggcccagttatagagagactcgttgtaatatcaagtgtggcttattttgtatttgag480tgttattttctcagctaatcttattagaatattggggtaactattccacttactattaga540tagatcatctctattatctgcgaatgatcaaagctacgttaaaccgtaaccccagatttt600ctgcaagttttttttttccatattgacttggcatttaatgtaagaggactatcagtatta660tcttcttctttttttcacttaaatggtagtactagtaaatgatttggacattattttctt720tgtgattcaattcaatgtatccaaatatttttccaattttgtatttattctacttttaca780atttgttttcttcttctcaaaactgtgaaccaataaaattatttcatttaaagccgtgga840aaaccactgaaaaggcccaatcatttgagagtaaaccaggtaattaaagccccaatcatt900cggttggattagtaaagtagtgccagaaagacaggagagcaataattacggtgaataagt960agagtggcgatgccacgtgtatataaaattgaccgtggaaaagacacaacaagaaaacaa1020aaccatagagaatagagatctgtaaaggaggagtacaaggataagagagagaaaaaaaga1080aaaaaaggaccccggaaagaaaaggaaaagagaagctgcccccatctcatctctcgtggc1140cgcctcatacttttctattcataaataaaaggcttcttcctttttcctcgacattcttta1200aagggctaggaggagtagtgaatctatcaaaccggcaacttcagcctctcgactctcttc1260tctctctctggttagttcttttcttttttaagttttgtacgctctgtgtttgctaccttt1320attattattattattattcgtgtcgaagttgaagaatcagtctttttttgccgatgcatc1380tctgtagctgtatactatatctgttacagtgtttctagattcttcattgtcacatctgga1440attggtctgattttgactctttcatacttttaattaattattataatgattagtctgtta1500atattattatatcgtatctatgtgtttgtgctagtagaacctcctcctgtacaggactag1560ttgtgcgatccatgtctgatttgttcttttttagattataaagttgctttctttttcttt1620ttgcttcaaacaggtttacccaatttcggacaactatatagctcccttcttgttcttgtt1680cttgtctcattcttgcttacccccttttatttttattttatcag1724<210>3<211>1039<212>DNA<213>印度芥菜<400>3gtagtactagtaaatgatttggacattattttctttgtgattcaattcaatgtatccaaa60tatttttccaattttgtatttattctacttttacaatttgttttcttcttctcaaaactg120tgaaccaataaaattatttcatttaaagccgtggaaaaccactgaaaaggcccaatcatt180tgagagtaaaccaggtaattaaagccccaatcattcggttggattagtaaagtagtgcca240gaaagacaggagagcaataattacggtgaataagtagagtggcgatgccacgtgtatata300aaattgaccgtggaaaagacacaacaagaaaacaaaaccatagagaatagagatctgtaa360aggaggagtacaaggataagagagagaaaaaaagaaaaaaaggaccccggaaagaaaagg420aaaagagaagctgcccccatctcatctctcgtggccgcctcatacttttctattcataaa480taaaaggcttcttcctttttcctcgacattctttaaagggctaggaggagtagtgaatct540atcaaaccggcaacttcagcctctcgactctcttctctctctctggttagttcttttctt600ttttaagttttgtacgctctgtgtttgctacctttattattattattattattcgtgtcg660aagttgaagaatcagtctttttttgccgatgcatctctgtagctgtatactatatctgtt720acagtgtttctagattcttcattgtcacatctggaattggtctgattttgactctttcat780acttttaattaattattataatgattagtctgttaatattattatatcgtatctatgtgt840ttgtgctagtagaacctcctcctgtacaggactagttgtgcgatccatgtctgatttgtt900cttttttagattataaagttgctttctttttctttttgcttcaaacaggtttacccaatt960tcggacaactatatagctcccttcttgttcttgttcttgtctcattcttgcttaccccct1020tttatttttattttatcag1039当前第1页1 2 3