一种印度芥菜的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种组织培养的方法，具体涉及一种印度芥菜的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]印度芥菜(Brassicajuncea L.)是一种高产、生长快的双二倍体十字花科植物，染色体条数为2n = 36。目前，我们国家对该领域的研究还是空白。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题弥补现有技术的空白，提供一种印度芥菜的组织培养方法
[0004]解决上述技术问题所采用的技术方案是一种印度芥菜的组织培养方法，包括如下步骤:
[0005]a将印度芥菜种子用蒸馏水浸泡5h，然后放入5-10%次氯酸钠溶液消毒10-20min，将次氯酸钠溶液放入废液罐，用无菌水清洗种子3-5次，然后将种子和经高压灭菌过的沙子按体积比I: 4-5混合，放入4°C冰箱，低温破休眠10-20天；
[0006]b然后将破休眠后芥菜种子播入培养基质；
[0007]c将印度芥菜地上部分取回组培室，用流水冲洗0.5-lh，去掉地上部分表面的灰尘、泥沙和微生物；
[0008]d将印度芥菜地上部分放入超净工作台，用70-75%酒精消毒40-60s，再用0.1%-
0.15%升汞消毒10-20min，将升汞溶液放到废液缸，然后用无菌水清洗地上部分8_10次，使残留在植株上的升汞和酒精洗掉；
[0009]e用解剖刀取0.5-lcm长茎尖放在培养基上，诱导印度芥菜愈伤的生成；
[0010]f将印度芥菜愈伤组织挑出，放入已转入目的基因的农杆菌悬浮液侵染5分钟；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干20min;将愈伤组织置于培养基上继续培养、筛选；
[0011]g将印度芥菜愈伤组织转到分化培养基上进行诱芽培养；
[0012]h将印度芥菜壮苗转接到生根培养基上进行生根培养；
[0013]i将组培瓶瓶盖打开，将试管苗放在室内培养3天，然后将试管苗取出组培瓶，洗掉根系上培养基，定植到步骤b的基质中，在温室内进行驯化炼苗培养10天，既得印度芥菜组培苗。
[0014I印度芥菜(Brassica juncea)对Cd、Pb、Zn等具有较强的抗耐性和富集能力，是目前筛选出的一种生长快、生物量大的土壤Pb、Cd、Zn的富集植物，印度芥菜生长速率和地上部生物量远远高于遏蓝菜，因此相同条件下印度芥菜对Cd等重金属的吸收总量高于遏蓝菜，在植物修复中具有更大的潜力.印度芥菜成为植物重金属吸收转运的机理机制研究，以及转基因研究的重要材料。通过本发明对印度芥菜愈伤组织的诱导以及分化培养和生根培养，可以为转基因、重金属转运机制研究提供基础材料。
【附图说明】
[0015]图1是NAA和6-BA激素配方对愈伤组织平均诱导率的影响；
[0016]图2是NAA浓度对无根苗平均生根率的影响。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
[0018]本发明公开一种印度芥菜的组织培养方法，包括如下步骤:
[0019]a将印度芥菜种子用蒸馏水浸泡5h，然后放入5-10%次氯酸钠溶液消毒10-20min，将次氯酸钠溶液放入废液罐，用无菌水清洗种子3-5次，然后将种子和经高压灭菌过的沙子按体积比I: 4-5混合，放入4°C冰箱，低温破休眠10-20天；
[0020]b然后将破休眠后芥菜种子播入培养基质；
[0021 ] c将印度芥菜地上部分取回组培室，用流水冲洗0.5-lh，去掉地上部分表面的灰尘、泥沙和微生物；
[0022]d将印度芥菜地上部分放入超净工作台，用70-75%酒精消毒40-60s，再用0.1%-
0.15%升汞消毒10-20min，将升汞溶液放到废液缸，然后用无菌水清洗地上部分8_10次，使残留在植株上的升汞和酒精洗掉；
[0023]e用解剖刀取0.5-lcm长茎尖放在培养基上，诱导印度芥菜愈伤的生成；
[0024]f将印度芥菜愈伤组织挑出，放入已转入目的基因的农杆菌悬浮液侵染5分钟；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干20min;将愈伤组织置于培养基上继续培养、筛选；
[0025]g将印度芥菜愈伤组织转到分化培养基上进行诱芽培养；
[0026]h将印度芥菜壮苗转接到生根培养基上进行生根培养；
[0027]i将组培瓶瓶盖打开，将试管苗放在室内培养3天，然后将试管苗取出组培瓶，洗掉根系上培养基，定植到步骤b的基质中，在温室内进行驯化炼苗培养10天，既得印度芥菜组培苗。
[0028]步骤b中培养基质由蛭石、珍珠岩、草炭按照1:1:3的重量比混合组成。
[0029]步骤e中培养基由1/2MS基本培养基+3 %蔗糖+0.7 %琼脂+0.8-1.2mg/L NAA+0.3-
0.5mg/L 6-BA组成。
[0030]步骤g中培养基由MS基本培养基+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.1-0.2mg/L NAA+l_2mg/L6-BA组成。
[0031]步骤h中培养基由MS基本培养基+3%蔗糖+0.7%琼脂+3.5-4mg/L NAA组成。
[0032]实施例1:
[0033]用于印度芥菜转基因的愈伤组织培育方法
[0034]1.用清水重力浮选法浮选比重大于I的印度芥菜种子，同时弃去比重小于I的种子。再将印度芥菜种子用蒸馏水浸泡5h，然后放入5%次氯酸钠溶液消毒20min，将次氯酸钠溶液放入废液罐，用无菌水清洗种子5次。然后将种子和经高压灭菌过的沙子按体积比1:5混合。放入4°C冰箱，低温破休眠1天。
[0035]2.破休眠后种子在30°C生化培养箱中催芽，将蛭石、珍珠岩、草炭按照1: 1:3的重量比混合作为培养基质，然后将破休眠、催芽后芥菜种子播入基质，在温室培养30天。
[0036]3.将上述生长正常、健壮印度芥菜植株从培养钵中拨出，洗净根系，连同地上部分取回组培室，用流水冲洗Ih，去掉地上部分表面的灰尘、泥沙和微生物。
[0037]4.将印度芥菜5cm长茎尖剪下，放入超净工作台，将玛卡茎尖用70%酒精消毒40s，再用0.15%升汞消毒lOmin，将升汞溶液放到废液缸，然后用无菌水清洗地上部分10次，使残留在植株上的升汞和酒精洗掉。
[0038]5.在超净工作台上，用解剖刀取0.5-lcm长茎尖割下，用镊子轻轻夹取茎尖放在I/2MS基本培养基+3 %蔗糖+0.7 %琼脂+NAA+6-BA培养基上，在组培室中培养30_40d诱导印度芥菜愈伤的生成。
[0039]作为实验优选的技术指标NAA浓度为lmg/L，6-BA浓度为0.5mg/L。
[0040]愈伤组织诱导率为82% (图1)
[0041 ] 6.在超净工作台上，将印度芥菜愈伤组织挑出，放入已转入目的基因的农杆菌悬浮液侵染5分钟;将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干20min;将愈伤组织置于培养基上继续培养、筛选。
[0042]实施例2:
[0043]用于印度芥菜转基因的愈伤组织培育方法
[0044]1.用清水重力浮选法浮选比重大于I的印度芥菜种子，同时弃去比重小于I的种子。再将印度芥菜种子用蒸馏水浸泡5h，然后放入8%次氯酸钠溶液消毒15min，将次氯酸钠溶液放入废液罐，用无菌水清洗种子4次。然后将种子和经高压灭菌过的沙子按体积比2:5混合。放入4°C冰箱，低温破休眠16天。
[0045]2.破休眠后种子在30°C生化培养箱中催芽，将蛭石、珍珠岩