一种超声波辅助外源基因转化甾短杆菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及外源基因导入微生物的方法，尤其涉及一种将构建的含有外源基因的 质粒导入留短杆菌的高效超声波转化方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 胆固醇氧化酶（EC 1. 1. 3. 6)是依赖辅酶FAD，在食品开发、医疗保健、临床检测、 生物农药等方面具有广泛的应用价值的氧化还原酶家族酶类。动物性食品中含有大量的胆 固醇，而过量地摄入胆固醇会引起心血管、胆结石等疾病。胆固醇氧化酶可以将胆固醇氧化 为胆留-4-烯-3-酮。应用胆固醇氧化酶的氧化性质可以建立酶法检测胆固醇含量的检测 体系。此外，胆固醇的氧化产物胆留-4-烯-3-酮具有防心血病、抑制皮肤角质化、治疗肝 病和防止肥胖等药效。因此，胆固醇氧化酶是一种具有多种功能和用途的酶类，其主要来源 于微生物。
[0003] 野生菌的产酶能力在300U/L左右，满足不了工业生产要求。所以，学者们一直在 对菌种进行改造并优化发酵条件，以提高菌种产酶活力、胆固醇氧化酶的分离纯化及应用。 目前都集中在通过基因工程方法来提高胆固醇氧化酶产量。而常规的基因工程方法要求有 高端仪器设备，所用试剂昂贵且大多对人体和环境有害，超声波作为一种物理方法可以解 决这种不利。
[0004] 超声波转化是一种高效的将外源基因导入宿主的方法，目前在哺乳动物和植物中 应用较多，而在微生物上鲜见报道。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种超声波辅助外源基因转化留短杆菌的方法，该方法新颖、转化条 件温和、成本低、绿色环境，易于实现基因转化的方法，解决了现有方法转化率低，细胞活力 低，易死亡等问题。
[0006] 本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供一种超声波辅助外源基因转化留短杆菌的方法，所述方法为：将携带 外源基因的表达质粒与甾短杆菌感受态细胞悬液混合，调节pH值至7. 2~7. 8,在28~ 32°C、超声波场强200~500W的条件下进行转化反应，转化反应结束后，筛选获得含外源基 因的留短杆菌的阳性转化子；所述留短杆菌感受态细胞悬液是由留短杆菌感受态细胞与二 甲基亚砜混合而成。
[0008] 进一步，所述甾短杆菌感受态细胞悬液中细胞含量为1 X 107~1 X 108个细胞/mL， 二甲基亚砜体积终浓度为1-4%。
[0009] 进一步，所述转化反应在28~32°C、超声波场强200~500W的条件下反应10~ 30min〇
[0010] 进一步，所述外源基因为胆固醇氧化酶基因，核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0011] atgaccgala gccgggcgaa cagagccgal gcgactcggg gggUgcatc cglcicacgc cgicgallcc Llgcgggcgc aggicigacc gcgggagcca icgcgciclc glcgaigicg acclccgccl ccgcagcccc cagccgcacc clcgccgacg gcgaccgcgi ccclgcccic glcaicggca gtggaiacgg cggigccglc gccgcgclgc ggclgacgca ggccggiaic cccacgcaga icgicgagal gggccgcagc Igggacaccc cgggclccga cggcaagalc Ucigcggga igctcaaccc cgacaagcgc Icgatgcggt iggccgacaa gaccgalcag ccgglcagca acllcalggg cilcggcatc aacaagagca lcgaccggla cglcggcglc cicgaclccg agcggticic cggcalcaag giclaccagg gccgcggcgt cggcggcggc Icgcicgtca acggcgglai ggcagicacc ccgaagcgca acLactlcga ggagaicclg ccgtcggicg actcgaacga galglacaac aaglacllcc cgcgcgccaa caccgglclg gglgtcaaca acatcgacca ggcgtggtic gagiccaccg aglgglacaa gllcgcccgc accggccgca agaccgccca acgiicgggl Ucacaaccg clllcgigcc caacglgtac gactlcgagl acatgaagaa ggaggcigcc ggccaggtca ccaaglcggg cclcggcggi gagglcalcl acggcaacaa cgccggcaag aaglcgclcg acaagaccla cctcgcgcag gccgcggcca ccgggaagci gacgaicacg aciUgcacc gcgt.caccaa ggicgcgccg gccaccggca gcggclacag cglgacgaig gaacagatcg acgagcaggg caacgtcgtc gccaccaagg Icglcaccgc cgalcggglg UcUcgcgg ccggcagcgl cggcaccagc aagcicctgg Iclcgalgaa ggcgcagggc cacclgccga acclgicglc gcaagtcggc gagggclggg gcaacaacgg caacatcaig glgggccgcg cgaaccacal glgggacgcc accggai.cca agcaggccac catcccgacg algggaalcg acaacigggc cgacccggcg gcaccgaici icgcggagai cgccccgclg ccggccgggc icgagaccia cgtcagccig lacciggcca tcacgaagaa ccccgaacgi gctcgcttcc agitcaallc gggcaccggc aaggtcgalc icaccigggc Icaglcgcag aaccagaagg gcaicgacai ggccaagaag glgllcgaca agalcaacca gaaggaaggc acgalclacc ggaccgalcl gilcggcglg lacaagacgt ggggcgacga cllcacgtac cacccgctgg gcggcgtgcL gclgaacaag gcgaccgaca actlcggccg cclgcccgag laccccgggc lgiacglggl ggacggctcg ctcglccccg gcaaiglcgg cglcaacccg Ucglcacga tcaccgcgcl cgccgagcgc aacaiggaca agalcalclc glccgacaic cagiga.；
[0012] 进一步，所述留短杆菌为留短杆菌（Brevibacterium sp. )DGCDC-82,保藏编号为 CCTCC NO :M207182,购自中国典型培养物保藏中心。
[0013] 进一步，所述携带外源基因的表达质粒与留短杆菌感受态细胞悬液体积比为 1:40-55〇
[0014] 进一步，所述留短杆菌感受态细胞按如下步骤制备：将留短杆菌接种至LB液体 培养基中，150~180r/min，28~32°C振荡培养至指数生长后期（通常培养16~24h)， 12000r/min，10~15min，4°C离心，收集湿菌体，获得留短杆菌感受态细胞。
[0015] 进一步，所述携带胆固醇氧化酶基因的表达质粒为pET28a_choB载体质粒。
[0016] 本发明所述超声波辅助外源基因转化留短杆菌的方法，具体按如下步骤进行：
[0017] (1)留短杆菌感受态细胞的培养和收集
[0018] 挑取甾短杆菌（优选甾短杆菌DG⑶C-82)单菌落接种至LB液体培养基中，150~ 180r/min，28~32°C振荡培养至指数生长后期（通常培养16~24h)，12000r/min，10~ 15min，4°C离心，收集湿菌体，获得留短杆菌感受态细胞；
[0019] (2)以甾短杆菌为宿主的基因转化研究
[0020] 将甾短杆菌感受态细胞与二甲基亚砜混合制成细胞含量为IX 107~IX 10 8个 细胞/mL的细胞悬液（二甲基亚砜体积终浓度为1-4%，），添加携带胆固醇氧化酶基因的 pET28a载体质粒，在pH值至L 2~L 8、28~32°C、超声波场强200~500W下，经超声波 作用进行转化反应，分别考察场强和处理时间等参数对转化的影响；
[0021] (3)阳性转化子的筛选
[0022] 当转化结束后，将转化后的菌液涂布到含50~100 μ g/mLKan和50~100 μ g/mL Cam的LB平板上，28~30°C条件下培养48~72h，筛选获得到阳性转化子；
[0023] (4)阳性转化子的鉴定
[0024] 随机选取转化平板上的转化子提取基因组DNA，以其为模板，采用特异性引物进行 PCR 验证。所用引物：5' -TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3' 和 5' -GCGAATTCTCACTGGATGT CGGACGAGATGA-3'。PCR 反应条件为：94°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，30 个循环； 72°C 5min ;凝胶电泳检测重组载体是否插入留短杆菌基因组。
[0025] (5)产物表达
[0026] 鉴定好的转化子接种到含50~100 μ g/mL Kan和50~100 μ g/mL Cam的LB液 体培养基中，在28~32°C培养16~24小时达到对数生长期后，加 IPTG至终浓度为0. 8~ 1. 2mmol/L，继续培养3~5h，检测胆固醇氧化酶酶活。
[0027] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0028] 1)目前报道多集中在超声诱导植物和动物基因转化，本发明拟以超声波方法诱导 微生物基因转化。
[0029] 2)常用的基因转化方法有基因工程法和电穿孔法，基因工程法要求有高端仪器设 备，所用试剂昂贵且大多对人体和环境有害；电穿孔要求有较低的离子介质和较高的电压， 并且接合要求有直接细胞-细胞接触。本发明所述超声波诱导基因转化方法更加环保，不 依赖于细胞型，且转化率和电转化率相当。转化率达418个阳性转化子/ μ g质粒DNA，其 中产量最高的较出发菌株的〇. 5U/mL提高到1.32U/mL，提高了 164%。本发明与现有的电 转化方法相比除具有上述优势外，转化效率也与电转化相当或高于电转化，如发明专利一 种电转化热纤梭菌（Clostridium thermocellum)的方法（CN201110048349. 9)的转化率为 10 2 ~10 ^ (四）
【附图说明】
[0030] 图1为实施例1阳性转化子筛选凝胶电泳图，泳道Μ为Marker，泳道1为阳性转化 子。
[0031] 图2为实施例2阳性转化子筛选凝胶电泳图，泳道Μ为Marker，泳道1为阳性转化 子。
[0032] 图3为实施例3阳性转化子筛选凝胶电泳图，泳道Μ为Marker，泳道1为阳性转化 子。 (五）
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0034] LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容