一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程
技术领域：
，更具体的说是涉及一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
：微生物转化法是利用微生物细胞产生的一种或者多种酶把一种化合物变成结构相关的更有经济价值的产物，其本质是利用微生物本身所产生的酶对外源底物进行的催化反应。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统，大肠杆菌由于遗传背景简单，容易培养，以及由大量可供选择的克隆载体与表达载体，使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株。甾体激素(steroidhormone)，包括肾上腺皮质激素和性激素，它是一类维持生命、保持正常生活、促进性器官发育、维持生育的重要生物活性物质。甾体激素药物是指分子结构中含有甾体结构的激素类药物，是临床上一类重要的药物，主要包括肾上腺皮质激素(adrenocorticohormones)和性激素(sexhormone)两大类。皮质激素类药物用于临床的有醋酸可的松(cortisoneacetate)、氢化可的松(hydrocortisone)等。21-脱氧皮质醇(21-Deoxycortisol，4-Pregnene-11beta,17alpha-diol-3,20-dione，C21H30O4，分子量346.4605)是一种重要的甾体激素，同时也是一种重要的甾体激素合成的中间体，它是由17α-羟孕酮(17α-Hydroxyprogesterone，17alpha-Hydroxy-4-pregnene-3,20-dione，C21H30O3，分子量330.4611)11位被氧化成β构型的羟基而得到。目前还未有生物全合成或者生物转化生成21-脱氧皮质醇的文献及专利发表。因此，在大肠杆菌中将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇是一个非常具有前景的能够运用于工业上的技术。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组质粒，使得所述重组质粒转化到大肠杆菌中能够将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇并具有较高产量，可应用于转化生成21-脱氧皮质醇的重组工程菌的构建中。本发明的另一个目的在于提供一种重组工程菌，使得所述重组工程菌能够将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇并具有较高产量，可应用于21-脱氧皮质醇的微生物转化中。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：一种重组质粒，在基础质粒上包括T7启动子、T7终止子、11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR，所述11位β羟化酶能基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR位于T7启动子和T7终止子之间。本发明将11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR通过T7启动子和终止子开启表达，由此构建出重组质粒，利用该重组质粒转化到工程菌中可实现将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇并具有较高产量。其中，作为优选，所述基础质粒为pET21a质粒，其上包含T7启动子和T7终止子，是一种商品化质粒，在构建时较为方便，本发明同时也可使用额外添加T7启动子和T7终止子的其他适合质粒。在本发明的具体实施方式中，所述11位β羟化酶基因CYP11B1为人源(Homosapiens)、牛源(BosTaurus)、褐家鼠来源(Rattusnorvegicus)，羊源(Ovisaries)、袋獾来源(Sarcophilusharrisii)、狐蝠源(PteropusAlecto)或日本鬼伞科蘑菇来源(Coprinopsiscinereaokayama7#130)的野生型CYP11B1或突变型CYP11B1；为了方便表述，在本发明中可简写为Hs野生型或突变型CYP11B1、Rn野生型或突变型CYP11B1、Bt野生型或突变型CYP11B1、Oa野生型或突变型CYP11B1、Sh野生型或突变型CYP11B1、Pa野生型或突变型CYP11B1、Cc野生型或突变型CYP11B1。在本发明的具体实施方式中，所述电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR均为牛源(BosTaurus)基因。作为优选，上述突变型的各来源CYP11B1都将疏水端N端编码23位的氨基酸突变成为了编码亲水性精氨酸的核苷酸序列，具体所述人源、牛源、褐家鼠来源，羊源、袋獾来源、狐蝠源以及日本鬼伞科蘑菇来源的突变型CYP11B1核苷酸序列依次如SEQIDNO:1-7所示；所述牛源Adx是编码4到108位氨基酸的核苷酸序列，具体所述电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR核苷酸序列依次如SEQIDNO:8-9所示；上述各基因均适当规避常用限制性酶切位点后通过人工合成得到，在本发明具体实施方式中，为了改善转入的大肠杆菌工程菌高效生物转化效率，SEQIDNO:1-9所示核苷酸序列还经过大肠杆菌密码子优化。同时，本发明根据所述重组质粒所能实现的技术效果提出了其在将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇中的应用和/或在制备将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇的工程菌中的应用；作为优选，所述工程菌为大肠杆菌，更优选地为MG1655(DE3)菌株，该菌株是MassachusettsInstituteofTechnology的KristalaL.J.Prather教授文章中发布的菌株(TsengHC,HarwellCL,MartinCH,etal.Biosynthesisofchiral3-hydroxyvaleratefromsinglepropionate-unrelatedcarbonsourcesinmetabolicallyengineeredE.coli[J].Microbialcellfactories,2010,9(1):1)，文中详细记载了将市售MG1655大肠杆菌通过基因工程技术改造为一类能够有效表达异源蛋白的菌株，统一命名为MG1655(DE3)。本发明还对应提供了所述重组质粒的构建方法，包括：将11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR通过酶切方式连接到包含T7启动子和T7终止子的基础质粒上，所述11位β羟化酶能基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR位于T7启动子和T7终止子之间，获得重组质粒。作为优选，所述构建方法包括：分别在11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx和电子传递体基因AdR5’端添加NdeI酶切位点、3’端添加SpeI酶切位点，然后分别将三个外源基因通过SpeI和NdeI酶切后，连入添加有SpeI酶切位点的pET21a质粒中，得到pET21a-CYP11B1质粒、pET21a-Adx质粒和pET21a-AdR质粒，所述SpeI酶切位点位于NdeI和BamHI酶切位点之间；将pET21a-CYP11B1质粒、pET21a-Adx质粒和pET21a-AdR质粒中任意两个质粒分别进行XbaI和BamHI酶切获得两个目的基因，将两个目的基因逐个与进行SpeI和BamHI酶切的剩余质粒连接，获得重组质粒。在上述构建方法中，本发明采用biobrick的构建策略，利用SpeI与XbaI是同尾酶，经过处理后会留下相同的粘性末端的特点，在T4连接酶的作用下将所需要的三个外源基因逐个连接到基础质粒上，并且保证已连接的外源基因不受后续酶切影响。更为优选地，所述构建方法包括：分别在11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx和电子传递体基因AdR5’端添加核苷酸序列CAT、3’端添加核苷酸序列CTAGT，然后分别将三个外源基因通过SpeI和NdeI酶切后，连入添加有SpeI酶切位点的pET21a质粒中，得到pET21a-CYP11B1质粒、pET21a-Adx质粒和pET21a-AdR质粒，所述SpeI酶切位点位于NdeI和BamHI酶切位点之间；将pET21a-CYP11B1质粒和pET21a-AdR质粒分别进行XbaI和BamHI酶切获得CYP11B1、AdR两个目的基因，先将CYP11B1与进行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx质粒连接，获得pET21a-Adx-CYP11B1质粒，然后再将AdR与进行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx-CYP11B1质粒连接，获得重组质粒。根据所述重组质粒在制备将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇的工程菌中的应用，本发明提供了一种重组工程菌，其转化有本发明所述重组质粒。作为优选，所述工程菌为大肠杆菌，更优选为MG1655(DE3)菌株。作为优选，上述重组工程菌还转化有包含帮助外源表达蛋白正确折叠的基因的质粒；更优选地，所述质粒为包含分子伴侣基因grdES和分子伴侣基因grdEL的质粒；在具体的实施方式中，该质粒选择为pGro7质粒。将所述重组工程菌应用到17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇中，其不但可以成功的生产出21-脱氧皮质醇，并且具有较高的产量，其中以人源和牛源的CYP11B1产量最高，野生型可达到60mg/(L*d)以上，突变型可达到180mg/(L*d)以上。因此，本发明提出了所述重组工程菌在将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇中的应用。对应的，所述重组工程菌的构建方法为将所述重组质粒转化到工程菌中，转化方法可采用本领域常规方法，例如电转化法。此外，本发明还提供了一种将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇的方法，将所述重组工程菌接种至种子培养基活化培养，然后再转接到发酵培养基中发酵培养，加入L-阿拉伯糖、IPTG、红血素前体deta-氨基乙酰丙酸、氨苄青霉素诱导表达，然后收集细胞并清洗，将细胞重悬在包含17α-羟孕酮的磷酸缓冲液中进行生物转化10-24h，从发酵液中分离提取21-脱氧皮质醇。更为具体地，将所述重组工程菌接种至种子培养基中在37℃、250rpm下活化培养14-16h，然后以初始菌体浓度OD600＝0.05转接到发酵培养基中在37℃、250rpm下发酵培养至OD600＝0.6-0.8，加入4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM红血素前体deta-氨基乙酰丙酸，50μg/mL氨苄青霉素在27.5℃，200rpm下诱导表达21h，然后收集细胞并清洗，将细胞重悬在包含17α-羟孕酮的磷酸缓冲液中在27.5℃、170rpm下进行生物转化10-24h，转化完成后从发酵液中分离提取21-脱氧皮质醇。其中，所述种子培养基和发酵培养基均优选为每升蒸馏水中包含12g蛋白胨、24g酵母提取物、4mL甘油、4.62gKH2PO4、25gK2HPO4、50mg氨苄青霉素、50mg氯霉素的培养基。所述包含17α-羟孕酮的磷酸缓冲液优选为pH7.4，配制方法如下：6.98gK2HPO4，1.35gKH2PO4溶解于1L的蒸馏水中，加入40mL甘油、50μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM红血素前体deta-氨基乙酰丙酸、0.72mg/mL的17α-羟孕酮。由以上技术方案可知，本发明为17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇提供优化的外源基因，选取多种来源的11位β羟化酶基因CYP11B1以及电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR，整合至T7启动子和终止子基础质粒上，构建出的重组质粒转化至工程菌中能够实现21-脱氧皮质醇的高产。附图说明图1所示为商品化质粒pGro7(A图)和pET21a(B图)图谱；图2所示为添加有SpeI酶切位点的pET21a质粒图谱；图3所示为商品化质粒pUC57图谱；图4-6所示为本发明所述重组质粒构建流程示意图；图7所示为各种来源的突变型CYP11B1重组大肠杆菌的摇瓶发酵试验柱形图；图8所示为各种来源的野生型CYP11B1重组大肠杆菌的摇瓶发酵试验柱形图。具体实施方式本发明公开了一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品、方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在本发明中所涉及的一些质粒载体、菌株均可市售获得，如pET21a质粒可购自Takara，质粒图谱见图1，在其基础上添加有SpeI酶切位点的pET21a质粒图谱见图2；菌株MG1655可购自ATCC；质粒pGro7可购自Takara，质粒图谱见图1；在全合成本发明所需要的各外源基因过程中，需要将其连接到质粒载体上保存，在本发明具体实施方式中采用pUC57质粒，可购自Takara，质粒图谱见图3。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1：重组质粒的构建全合成β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx和电子传递体基因AdR，同时分别在11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx和电子传递体基因AdR5’端添加核苷酸序列CAT、3’端添加核苷酸序列CTAGT连接到pUC57质粒中保存，然后分别将三个外源基因通过SpeI和NdeI酶切后，连入添加有SpeI酶切位点的pET21a质粒中，得到pET21a-CYP11B1质粒、pET21a-Adx质粒和pET21a-AdR质粒，所述SpeI酶切位点位于NdeI和BamHI酶切位点之间；将pET21a-CYP11B1质粒和pET21a-AdR质粒分别进行XbaI和BamHI酶切获得CYP11B1、AdR两个目的基因，先将CYP11B1与进行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx质粒连接，获得pET21a-Adx-CYP11B1质粒，然后再将AdR与进行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx-CYP11B1质粒连接，获得重组质粒(构建流程图见图4-6)。上述构建的质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。实施例2：重组大肠杆菌的构建将质粒pGro7(含有分子伴侣基因grdES和grdEL，能够帮助外源表达蛋白的正确折叠)通过电转化法导入到大肠杆菌MG1655(DE3)中，转化后采用LB+Cmr平板(琼脂粉15g/L，NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，氯霉素38μg/L)进行筛选。在平板上挑出单菌落后，接种到LB+Cmr液体培养基(NaCl10g/L，Pepone10g/L，Yeastextract10g/L，氯霉素38μg/L)中进行培养，并保存甘油菌，命名为MG1655(DE3)-pGro7。将MG1655(DE3)-pGro7菌株做成电转感受态，将按照实施例1方法构建的重组质粒导入感受态细胞中，转化后采用LB+Cmr+Ampr平板(琼脂粉15g/L，NaCl10g/L，Pepone10g/L，Yeastextract10g/L，氯霉素38μg/L，氨苄青霉素100μg/L)进行筛选。筛选平板上的单菌落，获得重组大肠杆菌。实施例3：重组大肠杆菌的21-脱氧皮质醇摇瓶发酵种子培养基：12g蛋白胨、24g酵母提取物、4mL甘油、4.62gKH2PO4、25gK2HPO4、50mg氨苄青霉素、50mg氯霉素溶解于1L的蒸馏水中；发酵培养基：12g蛋白胨、24g酵母提取物、4mL甘油、4.62gKH2PO4、25gK2HPO4、50mg氨苄青霉素、50mg氯霉素溶解于1L的蒸馏水中。将按照实施例2构建的重组菌株接种于5mL种子培养基中，在37℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.05分别接种于50mL发酵培养基中，于37℃、250rpm条件下培养至OD600＝0.6-0.8，加入4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM红血素前体deta-氨基乙酰丙酸，50μg/mL氨苄青霉素诱导分子伴侣蛋白和CYP11B1及其电子传递体蛋白表达。27.5℃，200rpm蛋白表达21h后，8000rpm，1min收集细胞，将细胞用4℃无菌PH＝7.4的磷酸缓冲液(6.98gK2HPO4，1.35gKH2PO4溶解于1L的蒸馏水中，121℃，20min灭菌)清洗2遍，将细菌重悬在50mL无菌PH＝7.4的磷酸缓冲液(6.98gK2HPO4，1.35gKH2PO4溶解于1L的蒸馏水中，加入40mL甘油、50μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM红血素前体deta-氨基乙酰丙酸)中，27.5℃170rpm培养24h。底物的添加方法：将17α-羟孕酮溶解于50％β-环糊精(将500gβ环糊精溶解于1L蒸馏水)中，配成36mg/mL的母液，每50mL磷酸缓冲液中加入1mL底物母液。实施例4：人源突变型CYP11B1重组大肠杆菌的摇瓶发酵试验外源基因：Hs突变型CYP11B1(SEQIDNO:1)、牛源Adx(SEQIDNO:8)、牛源AdR(SEQIDNO:9)；将上述外源基因按照实施例1-3的方法构建获得人源突变型CYP11B1重组大肠杆菌，命名为SyBE_Ec02040086，然后进行摇瓶发酵24h，以MG1655(DE3)菌株和MG1655(DE3)-pGro7菌株作为对照。产物提取及检测方法：取10mL发酵液，用等体积的二氯甲烷萃取两次，12000rpm、4℃离心5min，取下部萃取液5mL用纯净的氮气吹干，然后加入5mL二氯甲烷涡旋1min溶解，12000rpm、4℃离心5min，取上部无沉淀洁净萃取液2mL用纯净的氮气吹干。用1mL甲醇溶解白色的析出物，用2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，21-脱氧皮质醇的检测波长为450nm，结果见表1。表121-脱氧皮质醇产量菌株21-脱氧皮质醇产量SyBE_Ec02040086178.945mg/(L*d)MG1655(DE3)0MG1655(DE3)-pGro70由表1可以得知，转化有本发明所述重组质粒的大肠杆菌能够利用底物17α-羟孕酮，并将其生物转化为21-脱氧皮质醇，且具有较高的产量，而未转化质粒以及仅转化有pGro7的菌株产量均为0。实施例5：各种来源的突变型CYP11B1重组大肠杆菌的摇瓶发酵试验外源基因：Hs突变型CYP11B1、Bt突变型CYP11B1、Rn突变型CYP11B1、Oa突变型CYP11B1、Sh突变型CYP11B1、Pa突变型CYP11B1、Cc突变型CYP11B1(SEQIDNO:1-7)；牛源Adx(SEQIDNO:8)、牛源AdR(SEQIDNO:9)；另外，增加Sa突变型CYP11B1(鼩鼱来源，Sorexaraneus，SEQIDNO:10)、Mo野生型CYP11B1(稻瘟病菌来源，MagnaportheoryzaeP131，SEQIDNO:11)作为对照，其同样在野生型基因序列基础上将疏水端N端编码23位的氨基酸突变成为了编码亲水性精氨酸的核苷酸序列，并经过大肠杆菌密码子优化。将上述外源基因按照实施例1-2的方法构建获得各种来源的突变型CYP11B1重组大肠杆菌，重复构建3次，每个来源的突变型CYP11B1重组大肠杆菌为3株，命名如下：MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-HsCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-BtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-RnCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-OaCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-ShCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-SaCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-PaCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-CcCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-MoCYP11B1-Adx-AdR；然后按照实施例3的方法进行摇瓶发酵(将各来源的3株重组菌株分别进行，最后统计各来源重组菌株发酵结果的平均值)，结果见图7。由图7可知，各重组菌株中以人源突变型CYP11B1重组大肠杆菌以及牛源突变型CYP11B1重组大肠杆菌产量较高，而作为对照的Sa突变型CYP11B1重组大肠杆菌产量为0，Mo野生型CYP11B1重组大肠杆菌产量较低，表明并不是所有来源的CYP11B1经过突变优化均能够实现高产量转化目的。实施例6：各种来源的野生型CYP11B1重组大肠杆菌的摇瓶发酵试验外源基因：Hs野生型CYP11B1、Rn野生型CYP11B1、Bt野生型CYP11B1、Oa野生型CYP11B1、Sh野生型CYP11B1、Sa野生型CYP11B1、Pa野生型CYP11B1、Cc野生型CYP11B1、Mo野生型CYP11B1；牛源Adx(SEQIDNO:8)、牛源AdR(SEQIDNO:9)；其中，Sa野生型CYP11B1、Mo野生型CYP11B1作为对照，并且经过大肠杆菌密码子优化。将上述外源基因按照实施例1-2的方法构建获得各种来源的野生型CYP11B1重组大肠杆菌，重复构建3次，每个来源的野生型CYP11B1重组大肠杆菌为3株，命名如下：MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-HswtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-BtwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-RnwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-OawtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-ShwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-SawtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-PawtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-CcwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-MowtCYP11B1-Adx-AdR；然后按照实施例3的方法进行摇瓶发酵(将各来源的3株重组菌株分别进行，最后统计各来源重组菌株发酵结果的平均值)，结果见图8。由图8可知，各重组菌株中以人源野生型CYP11B1重组大肠杆菌以及牛源突变型CYP11B1重组大肠杆菌产量较高，而作为对照的Sa野生型CYP11B1以及Mo野生型CYP11B1重组大肠杆菌产量均为0，表明并不是所有来源的CYP11B1均能够实现转化目的。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>天津大学<120>一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和应用<130>MP1616356<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1512<212>DNA<213>人工序列<400>1atggcgctgcgtgcgaaagcggaagtgtgcatggcggttccgtggctgagcctgcaacgt60gcgcaagcgctgcgtacccgtgcggcgcgtgtgccgcgtaccgttctgccgtttgaagcg120atgccgcgtcgtccgggtaaccgttggctgcgtctgctgcaaatctggcgtgagcaaggc180tacgaagacctgcacctggaagtgcaccagaccttccaagaactgggtccgatttttcgt240tatgatctgggtggcgcgggcatggtgtgcgttatgctgccggaggacgtggaaaagctg300caacaagttgatagcctgcacccgcaccgtatgagcctggagccgtgggtggcgtaccgt360cagcaccgtggtcacaagtgcggcgtttttctgctgaacggtccggagtggcgtttcaac420cgtctgcgtctgaacccggaagtgctgagcccgaacgcggttcaacgttttctgccgatg480gtggacgcggttgcgcgtgatttcagccaggcgctgaagaaaaaggtgctgcaaaacgcg540cgtggtagcctgaccctggacgttcagccgagcatctttcactataccattgaggcgagc600aacctggcgctgttcggcgaacgtctgggtctggttggccatagcccgagcagcgcgagc660ctgaacttcctgcacgcgctggaagtgatgtttaagagcaccgttcagctgatgttcatg720ccgcgtagcctgagccgttggaccagcccgaaagtgtggaaggagcacttcgaagcgtgg780gactgcatctttcaatacggtgataactgcatccagaaaatttatcaagagctggcgttt840agccgtccgcagcaatacaccagcatcgttgcggagctgctgctgaacgcggaactgagc900ccggacgcgattaaggcgaacagcatggaactgaccgcgggcagcgtggataccaccgtt960ttcccgctgctgatgaccctgtttgagctggcgcgtaacccgaacgtgcagcaagcgctg1020cgtcaggaaagcctggctgcggcggcgagcattagcgagcacccgcaaaaagcgaccacc1080gaactgccgctgctgcgtgcggcgctgaaggaaaccctgcgtctgtatccggtgggtctg1140ttcctggaacgtgtggcgagcagcgacctggttctgcaaaactaccacatcccggcgggt1200accctggtgcgtgtttttctgtatagcctgggtcgtaacccggcgctgtttccgcgtccg1260gagcgttacaacccgcagcgttggctggatattcgtggtagcggccgtaacttttatcac1320gtgccgttcggttttggcatgcgtcagtgcctgggccgtcgtctggcggaggcggaaatg1380ctgctgctgctgcaccacgtgctgaaacacctgcaagttgaaaccctgacccaagaagat1440atcaagatggtttacagcttcattctgcgtccgagcatgttcccgctgctgacctttcgt1500gcgatcaactaa1512<210>2<211>1512<212>DNA<213>人工序列<400>2atggcgctgtgggcgaaagcgcgtgtgcgtatggcgggtccgtggctgagcctgcatgaa60gcgcgtctgctgcgtacccgtggtgcggcggcgccgaaagcggttctgccgtttgaggcg120atgccgcgttgcccgggtaacaagtggatgcgtatgctgcaaatctggaaagagcaaagc180agcgaaaacatgcacctggacatgcaccagaccttccaagaactgggcccgatttttcgt240tacgatgtgggtggccgtcacatggtgttcgttatgctgccggaggacgttgaacgtctg300caacaagcggatagccaccacccgcagcgtatgatcctggagccgtggctggcgtatcgt360caagcgcgtggtcacaagtgcggcgtgtttctgctgaacggtccgcagtggcgtctggac420cgtctgcgtctgaacccggatgttctgagcctgccggcgctgcaaaagtacaccccgctg480gttgacggcgttgcgcgtgatttcagccagaccctgaaagcgcgtgtgctgcaaaacgcg540cgtggtagcctgaccctgggtcaccgtgcgcagctgtttcgttacaccatcgaagcgagc600accctggttctgtatggcgagcgtctgggcctgctgacccagcaaccgaacccggacagc660ctgaacttcattcacgcgctggaagcgatgctgaagagcaccgtgcagctgatgtttgtt720ccgcgtcgtctgagccgttggatgagcaccaacatgtggcgtgagcacttcgaagcgtgg780gattacatctttcaatatgcgaaccgtgcgatccagcgtatttaccaagaactggcgctg840ggtcacccgtggcactatagcggcattgtggcggagctgctgatgcgtgcggacatgacc900ctggataccatcaaagcgaacaccattgacctgaccgcgggtagcgttgataccaccgcg960ttcccgctgctgatgaccctgtttgaactggcgcgtaacccggaagtgcagcaagcggtt1020cgtcaggagagcctggtggcggaagcgcgtatcagcgagaacccgcaacgtgcgattacc1080gaactgccgctgctgcgtgcggcgctgaaggaaaccctgcgtctgtatccggttggcatc1140accctggagcgtgaagtgagcagcgacctggttctgcaaaactaccacattccggcgggt1200accctggtgaaagttctgctgtatagcctgggtcgtaacccggcggtgtttgcgcgtccg1260gaaagctaccacccgcagcgttggctggatcgtcaaggtagcggcagccgttttccgcac1320ctggcgttcggttttggcgttcgtcagtgcctgggtcgtcgtgtggcggaagtggaaatg1380ctgctgctgctgcaccacgtgctgaagaacttcctggttgaaaccctggagcaggaagac1440atcaaaatggtgtatcgttttattctgatgccgagcaccctgccgctgttcacctttcgt1500gcgatccaataa1512<210>3<211>1500<212>DNA<213>人工序列<400>3atggcgctgcgtgttaccgcggacgtttggctggcgcgtccgtggcaatgcctgcatcgt60acccgtgcgctgcgtaccaccgcgaaggtggcgccgaagaccctgaaaccgttcgaggcg120atcccgcaatacagccgtaacaagtggctgaaaatgatccagattctgcgtgagcagggt180caagaaaacctgcacctggagatgcaccaggcgttccaagaactgggcccgatctttcgt240cacagcgcgggtggcgcgcaaattgtgagcgttatgctgccggaggacgcggaaaagctg300caccaggttgaaagcatcctgccgcaccgtatgccgctggagccgtgggtggcgcaccgt360gaactgcgtggtctgcgtcgtggcgtttttctgctgaacggtgcggattggcgtttcaac420cgtctgcaactgaacccgaacatgctgagcccgaaagcgattcagagcttcgtgccgttt480gttgacgtggttgcgcgtgattttgtggagaacctgaagaaacgtatgctggaaaacgtt540cacggtagcatgagcatcaacatccaaagcaacatgttcaactacacgatggaggcgagc600cacttcgtgattagcggtgaacgtctgggtctgaccggtcacgatctgaagccggagagc660gttaccttcacccacgcgctgcacagcatgtttaagagcaccacccagctgatgttcctg720ccgaaaagcctgacccgttggaccagcacccgtgtgtggaaagagcacttcgacagctgg780gatatcattagcgaatacgtgaccaagtgcatcaaaaacgtttatcgtgagctggcggaa840ggtcgtcagcaaagctggagcgttattagcgagatggtggcgcagagcaccctgagcatg900gacgcgatccacgcgaacagcatggaactgattgcgggcagcgtggataccaccgcgatc960agcctggttatgaccctgtttgaactggcgcgtaacccggacgtgcagcaagcgctgcgt1020caagagagcctggcggcggaagcgagcattgttgcgaacccgcagaaggcgatgagcgat1080ctgccgctgctgcgtgcggcgctgaaagaaaccctgcgtctgtacccggtgggtagcttc1140gttgaacgtatcgtgcacagcgacctggttctgcaaaactatcacgtgccggcgggtacc1200tttgttatcatttacctgtatagcatgggccgtaacccggcggtgtttccgcgtccggag1260cgttacatgccgcagcgttggctggaacgcaagcgtagctttcaacacctggcgttcggt1320tttggcatgcgtcagtgcctgggccgtcgtctggcggaagtggaaatgctgctgctgctg1380caccacatgctgaaaaccttccaggtggaaaccctgcgtcaggaagatatgcaaatggtt1440ttccgttttctgctgatg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