表征急性毒性的重组质粒、重组菌及其构建方法与应用与流程

本发明涉及生物技术，尤其是涉及一种表征急性毒性的重组质粒、重组菌及其构建方法与应用。

背景技术：

随着工业化的发展以及农业领域中化学物的大量使用等，环境体系中，包括水体，大气及土壤等，储存了越来越多的有毒有害物质，造成了一系列的问题。(Jaffrezic-Renault,N.,Dzyadevych,S.V.,2008.Conductometric microbiosensors for environmental monitoring.Sensors 8:2569-2588)。当生命体暴露在这种环境里，他们的生长、繁殖以及物种变迁等均被这些有毒有害物质影响，从而造成疾病的发生。这其中不乏具有急性毒性的物质，人类或动物一次或短时间接触后即会引起中毒甚至死亡。因此，对于环境样品的毒性监测与检测成为了关乎生态系统安全和生命安全的重要问题。

目前常规的环境毒性物质检测主要采用化学分析方法进行，包括气相色谱法、高效液相色谱法、原子吸收光谱法等。虽然这些化学方法可以提供高灵敏度和精度，但他们也面临着预处理方法繁琐、仪器成本较高且无法在现场进行、仪器复杂需专业培训人员操作、耗时耗力等缺点。更重要的是，这些结果只能显示环境样品物质成分，但无法给出综合毒性评价，更无法体现该物质在环境中的生物有效性，忽略了毒性物质间的拮抗、加合和协同作用(Sorensen,S.J.,M.Burmolle,and L.H.Hansen,Making bio-sense of toxicity:new developments in whole-cell biosensors.Current Opinion in Biotechnology,2006.17(1):11-16)。因此，生物监测手段在评估环境样品对于生命体的危害性领域具有更重要的意义。其中，生物传感器检测方法具有快速、简单、高特异性和灵敏度且经济有效等优点，虽不能给出所有成分的具体浓度，但可以提供样品对于目标生物的综合毒性，近年来发展迅速。

传统发光菌是一类在自然界中分离的能够产生化学发光现象的微生物。当细胞受急性毒物影响时，发光强度下降。Bulich等(Bulich,A.A.,Hartman P.A..Evaluation of thallium acetate-citrate medium for isolation of enterococci.Applied Microbiology,1969,18(5):944-945)最早提出水环境毒性检测的发光细菌法，而明亮发光杆菌也已作为国家标准方法用于水质急性毒性测定(GB/T 15441-1995,水质急性毒性的测定发光细菌法)。基于生物传感器的急性毒性生物传感器原理为当启动基因为组成型表达时，毒性物质会抑制报道基因的转录和翻译，从而导致报道基因产物量(通常为发光强度)减少，因此通过检测报道基因强度即可表征毒性强度。该方法响应快速，操作简单，成本较低，是较为可靠的急性毒性快速检测手段。

目前已报道的急性毒性检测的传感细胞宿主主要为不动杆菌(唐慧,宋一之,姜博,陈光玉,贾建丽,张旭,李广贺.生物传感细胞ADP1_pWHlux在水环境急性毒性检测中的应用,环境科学,2015,36:3872-3877)等，并被应用于环境样品。该细胞为通过不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1转化pWHlux得到，其中pWHlux在pWH274质粒基础上插入发光基因片段luxCDABE构建得到。菌株生长及测试时采用含有200μg/mL氨苄西林(amp)的Luria-Bertani(LB)培养基。但因ADP1本身含有一个编码β-内酰胺酶的基因ampC，因此可以一定程度上抵抗β-内酰胺类抗生素，而氨苄西林本身即为β-内酰胺类抗生素的一种。因此在使用氨苄西林对细胞进行培养时，容易出现质粒表达不稳定或丢失的情况，从而导致细胞发光值的下降，影响毒性分析的准确度。因此，构建稳定表达的新型急性毒性菌株对于提高环境样品毒性分析的准确度与可靠性具有至关重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种表征急性毒性的重组菌及其构建方法与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种表征急性毒性的重组质粒，记为pWHKm_lux，所述的重组质粒含有卡那霉素抗性基因片段与报道基因片段，所述的报道基因片段具有独立的启动子，所述的启动子为组成型表达，当细胞暴露在毒性环境中，细胞活性受到抑制，报道基因表达量降低，因此通过检测报道基因强度即可表征毒性强度。

所述的重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述卡那霉素抗性基因片段从5'到3'方向的核苷酸序列为SEQ ID NO.1自5'末端第11179-12287位核苷酸片段。

所述的报道基因可为发光基因luxCDABE，所述luxCDABE基因从5'到3'方向的核苷酸序列为SEQ ID NO.1自5'末端第384-6181位核苷酸片段。所述luxCDABE基因使用原质粒的P_tet启动子，为组成型表达。

所述的表征急性毒性的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)卡那霉素抗性基因片段的获得：

以pRMJ1质粒为模板，PCR获得卡那霉素抗性基因，两个引物所设置的酶切位点与质粒pWH1274的AhdI和AatII相匹配，PCR反应后进行纯化，将纯化的PCR产物用限制性内切酶AhdI和AatII进行双酶切，获得卡那霉素抗性基因片段；

2)含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体pWHkm的获得：

用限制性内切酶AhdI和AatII酶切质粒pWH1274，用T4DNA连接酶将卡那霉素抗性基因片段与酶切的质粒pWH1274片段连接，卡那霉素抗性基因通过AhdI和AatII双酶切位点替换质粒pWH274中的氨苄西林抗性基因，获得含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体pWHkm，将其转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基筛选得到重组表达载体pWHkm；

3)报道基因片段的获得：

以pSalAR_lux质粒为模板，PCR获得报道基因luxCDABE片段，两个引物所设置的酶切位点为质粒pWH1274的BamHI，PCR反应后进行纯化，将纯化的PCR产物用限制性内切酶BamHI进行酶切，获得报道基因luxCDABE片段；

4)含有报道基因能够表征急性毒性的重组质粒pWHKm-lux的构建：

用限制性内切酶BamHI来酶切步骤2)所得重组表达载体pWHkm，用T4DNA连接酶将报道基因片段与酶切的重组表达载体pWHkm片段连接，获得含有报道基因能够表征急性毒性的重组质粒pWHKm-lux，重组质粒pWHKm-lux转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上筛选发光的菌落，提取质粒即为表征急性毒性的重组质粒。

上述构建表征急性毒性的重组质粒的方法给出了本领域常用的一种方法，也可以采用其他的生物操作方法。

一种表征急性毒性的重组菌，由表征急性毒性的重组质粒转化导入不动杆菌(Acinetobacter sp.)Acinetobacter baylyi ADP1中获得。

所述的重组菌命名为Acinetobacter baylyi HesenATox，已于2016年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.13117。

所述的重组菌以不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1为母体，包含质粒pWHKm_lux，所述的质粒含有卡那霉素抗性基因以及报道基因，所述的报道基因具有独立的启动子，所述的启动子为组成型表达，当细胞暴露在毒性环境中，细胞活性受到抑制，报道基因表达量降低，因此通过检测报道基因强度即可表征毒性强度。

另外，上面给出的重组菌是一株优选的菌株，本领域技术人员知晓，由表征急性毒性的重组质粒转化导入其他菌株中也可以获得具有相同征急性毒性功能的重组菌。

所述的表征急性毒性的重组菌可作为急性毒性物质的生物检测器。作为生物检测器进行检测的方法与操作步骤为本领域的常规方法与常规步骤。

所述的急性毒性物质包括含铬物质，如重铬酸钾等。

本发明中使用到的pRMJ1质粒具有已知结构与已知性能和构建方法，参考文献：Jones R.M.and Williams P.A.,Mutational analysis of the critical bases involved in activation of the AreR-regulated sigma(54)-dependent promoter in Acinetobacter sp strain ADP1.Applied and Environmental Microbiology,2003.69(9):5627-5635.

本发明中使用到的质粒pWH1274具有已知结构与已知性能和构建方法，参考文献：Hunger M.,Schmucker R.and Kishan V.et al.,Analysis and nucleotide sequence of an origin of DNA replication in Acinetobacter calcoaceticus and its use for Escherichia coli shuttle plasmids.Gene,1990,87:45-51.

本发明中使用到的pSalAR_lux质粒具有已知结构与已知性能和构建方法，参考文献：Huang W.E.,et al.,Chromosomally located gene fusions constructed in Acinetobacter sp.ADP1for the detection of salicylate.Environmental Microbiology,2005.7(9):1339-1348.

本发明中使用到的不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1为本领域内的一个已知菌株，别名Acinetobacter baylyi BD413或Acinetobacter baylyi ATCC33305，可从ATCC网站购买(https://www.atcc.org/Products/All/33305.aspx)。在许多专利(如CN101538549B)或文献中都有用到，比如以下文献：唐慧,宋一之,姜博,陈光玉,贾建丽,张旭,李广贺.生物传感细胞ADP1_pWHlux在水环境急性毒性检测中的应用,环境科学,2015,36:3872-3877。

原有报道(唐慧,宋一之,姜博,陈光玉,贾建丽,张旭,李广贺.生物传感细胞ADP1_pWHlux在水环境急性毒性检测中的应用,环境科学,2015,36:3872-3877)中使用的急性毒性传感器细胞为通过不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1转化pWHlux得到，其中pWHlux在pWH274质粒基础上插入发光基因片段luxCDABE构建得到。菌株生长及测试时采用含有200μg/mL氨苄西林(amp)的Luria-Bertani(LB)培养基。但因ADP1本身含有一个编码β-内酰胺酶的基因ampC，因此可以一定程度上抵抗β-内酰胺类抗生素，而氨苄西林本身即为β-内酰胺类抗生素的一种。因此在使用氨苄西林对细胞进行培养时，容易出现质粒表达不稳定或丢失的情况，从而导致细胞发光值的下降，影响毒性分析的准确度。本发明中Acinetobacter baylyi HesenATox包含质粒pWHKm-lux，其去除了氨苄西林抗性基因，增加了卡那霉素抗性基因。卡那霉素对于Acinetobacter sp.的生长抑制非常稳定，因此大大提高了分析的准确度。

附图说明

图1为Acinetobacter baylyi.HesenATox对重铬酸钾响应曲线；

图2为Acinetobacter baylyi.HesenATox测试不同环境样品。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：表征急性毒性重组菌的构建

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

1)插入卡那霉素抗性基因

以pRMJ1质粒(Jones,R.M.and P.A.Williams,Mutational analysis of the critical bases involved in activation of the AreR-regulated sigma(54)-dependent promoter in Acinetobacter sp strain ADP1.Applied and Environmental Microbiology,2003.69(9):5627-5635.)为模板，PCR获得卡那霉素抗性基因Km，两个引物根据基因的序列及载体的限制性内切酶位点而设计。

上游引物：5’-GACTCCCCGTCTCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCG-3’

下游引物：5’-GACGTCTGATCCGATCCACGCGTCTTAAGG-3’

两个引物所设置的酶切位点与载体pWH1274的AhdI和AatII相匹配。

PCR反应：在50μl反应体系中含有0.5μl DNA聚合酶(DreamTaq,Thermo Scientific)，10×DNA聚合酶缓冲液(DreamTaq buffer)5μl，模板质粒DNA(1μl，2mM dNTP混合物(脱氧核苷酸混合物，由脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸混合而成，每种核苷酸浓度0.2mM)5μl，上下游引物各加1μM，加无菌超纯水(ddH₂O)至总体积50μl。PCR反应程序为：95℃预变性3min；循环程序为95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；最后再72℃延伸10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，片段大小为1109bp。使用Qiagen的PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。

将纯化的PCR产物用限制性内切酶AhdI和AatII(NEB)进行双酶切。用同样的限制性内切酶AhdI和AatII(NEB)来酶切pWH1274(Hunger M.,Schmucker R.and Kishan V.et al.,Analysis and nucleotide sequence of an origin of DNA replication in Acinetobacter calcoaceticus and its use for Escherichia coli shuttle plasmids.Gene,1990,87:45-51)，然后再用磷酸酶(Antarctic Phosphatase，NEB)处理去磷酸化，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，再用胶回收试剂盒回收。

T4DNA连接酶(NEB)将上述片段连接，获得含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体pWHkm，将其转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞(由Promega公司购得)，通过含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基筛选重组体。

2)在BamHI位点插入发光基因

以pSalAR_lux(Huang,W.E.,et al.,Chromosomally located gene fusions constructed in Acinetobacter sp.ADP1for the detection of salicylate.Environmental Microbiology,2005.7(9):1339-1348.)质粒为模板，PCR获得luxCDABE片段，两个引物根据基因的序列及载体的限制性内切酶位点而设计。

上游引物：5’-GCGGATCCATGACTAAAAAAATTTCATTCATATTAACGG-3’

下游引物：5’-GCGGATCCTCAACTATCAAACGCTTCGGTTAAGCTTAAAGCAC-3’

两个引物所设置的酶切位点为BamHI。

PCR反应：在50μl反应体系中含有0.5μl DNA聚合酶(DreamTaq,Thermo Scientific)，10×DNA聚合酶缓冲液(DreamTaq buffer)5μl，模板质粒DNA(1μl，2mM dNTP混合物(脱氧核苷酸混合物，由脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸混合而成，每种核苷酸浓度0.2mM)5μl，上下游引物各加1μM，加无菌超纯水(ddH₂O)至总体积50μl。PCR反应程序为：95℃预变性3min；循环程序为95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸360s，共30个循环；最后再72℃延伸10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，片段大小为5814bp。使用Qiagen的PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。

将纯化的PCR产物用限制性内切酶BamHI(NEB)进行酶切。用同样的限制性内切酶BamHI(NEB)来酶切步骤1)获得质粒pWHkm，然后再用磷酸酶(Antarctic Phosphatase，NEB)处理去磷酸化，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，再用胶回收试剂盒回收。

用T4DNA连接酶(NEB)将上述两个片段连接，获得含有发光基因luxCDABE的重组表达载体pWHKm-lux。pWHKm-lux转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上筛选发光的菌落。

3)转化入ADP1获得重组菌

将上述获得的含有发光基因luxCDABE的重组表达载体pWHKm-lux转化入ADP1获得重组菌。

Acinetobacter baylyi ADP1感受态细胞的制备：在LB培养基中接种ADP1细胞；将28℃过夜培养的ADP1细胞按照体积比为1：20接种至新鲜LB培养基，30℃下震荡培养3小时。

通过离心将感受态细胞浓缩十倍，取500μL加入1μg pWHKm-lux质粒，在30℃下培养3小时。细胞涂布在含有10μg/mL卡那霉素的LB培养基上进行筛选，生长出的单克隆即为Acinetobacter baylyi.HesenATox，已于2016年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.13117。质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：Acinetobacter baylyi.HesenATox对急性毒性物质重铬酸钾的响应

1)细胞培养与准备

Acinetobacter baylyi.HesenATox单菌落接种至含有10μg/mL卡那霉素的LB培养基(LBK)，30℃培养过夜。新鲜LBK培养基将细胞稀释5倍，获得细胞悬浮液，待用。

2)样品准备

分别配制浓度为10、50、100、200、1000、5000和10000μM重铬酸钾的水溶液。

3)样品测试

取100μL步骤1)中稀释的细胞悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标版孔内。每孔分别加入100μL不同浓度的重铬酸钾水溶液，清水作为阴性对照。使用可以测量96孔板内化学发光和吸光度的多功能酶标仪(BioTek Synergy HT读板机，BioTek Corporation)。在37℃测量每个微孔的化学发光(lum)，并读取该孔在600nm波长处的吸光度(OD600)。每隔15分钟进行一次测量。测量期间96孔板在37℃下振荡培养。

4)数据处理

用相对发光率(IR)表征样品毒性。计算方法为1小时测试的样品发光值除以1小时测试的阴性对照发光值。

Acinetobacter baylyi.HesenATox对急性毒性物质重铬酸钾的响应如图1所示。随Cr离子浓度升高，重组菌的化学发光变弱，IR值降低。重铬酸钾的剂量与细胞相对发光率具有较好的剂量效应关系。

实施例3：Acinetobacter baylyi.HesenATox对环境水样急性毒性的判定

1)细胞培养与准备

Acinetobacter baylyi.HesenATox单菌落接种至含有10μg/mL卡那霉素的LB培养基(LBK)，30℃培养过夜。新鲜LBK培养基将细胞稀释5倍，获得细胞悬浮液，待用。

2)样品准备

分别配制浓度为1.04、2.6、5.2、10.4和26mg/L重铬酸钾的水溶液。

3)样品测试

取100μL步骤1)中稀释的细胞悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标版孔内。每孔分别加入100μL不同浓度的重铬酸钾水溶液做标准曲线，清水作为阴性对照。加入100μL的污水厂原废水、电镀厂废水、垃圾处理厂废水和自来水进行测试。使用可以测量96孔板内化学发光和吸光度的多功能酶标仪(BioTek Synergy HT读板机，BioTek Corporation)。在37℃测量每个微孔的化学发光(lum)，并读取该孔在600nm波长处的吸光度(OD600)。每隔15分钟进行一次测量。测量期间96孔板在37℃下振荡培养。

4)数据处理

用相对发光率(IR)表征样品毒性。计算方法为1小时测试的样品发光值除以1小时测试的阴性对照发光值。

Acinetobacter baylyi.HesenATox对环境样品响应如图2所示。通过Cr离子标准曲线换算得到，自来水和污水厂原废水不抑制发光，为无毒样品。电镀厂废水急性毒性相当于1.2mg/L重铬酸钾，而垃圾处理厂废水急性毒性相当于0.53mg/L重铬酸钾。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序 列 表

<110>上海合森生物科技有限公司

<120>表征急性毒性的重组质粒、重组菌及其构建方法与应用

<160>1

<210> 1

<211> 12356

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt 60

aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct 120

cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct 180

cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct 240

atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg 300

ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc 360

gaccacaccc gtcctgtgga tccatgacta aaaaaatttc attcattatt aacggccagg 420

ttgaaatctt tcccgaaagt gatgatttag tgcaatccat taattttggt gataatagtg 480

tttacctgcc aatattgaat gactctcatg taaaaaacat tattgattgt aatggaaata 540

acgaattacg gttgcataac attgtcaatt ttctctatac ggtagggcaa agatggaaaa 600

atgaagaata ctcaagacgc aggacataca ttcgtgactt aaaaaaatat atgggatatt 660

cagaagaaat ggctaagcta gaggccaatt ggatatctat gattttatgt tctaaaggcg 720

gcctttatga tgttgtagaa aatgaacttg gttctcgcca tatcatggat gaatggctac 780

ctcaggatga aagttatgtt cgggcttttc cgaaaggtaa atctgtacat ctgttggcag 840

gtaatgttcc attatctggg atcatgtcta tattacgcgc aattttaact aagaatcagt 900

gtattataaa aacatcgtca accgatcctt ttaccgctaa tgcattagcg ttaagtttta 960

ttgatgtaga ccctaatcat ccgataacgc gctctttatc tgttatatat tggccccacc 1020

aaggtgatac atcactcgca aaagaaatta tgcgacatgc ggatgttatt gtcgcttggg 1080

gagggccaga tgcgattaat tgggcggtag agcatgcgcc atcttatgct gatgtgatta 1140

aatttggttc taaaaagagt ctttgcatta tcgataatcc tgttgatttg acgtccgcag 1200

cgacaggtgc ggctcatgat gtttgttttt acgatcagcg agcttgtttt tctgcccaaa 1260

acatatatta catgggaaat cattatgagg aatttaagtt agcgttgata gaaaaactta 1320

atctatatgc gcatatatta ccgaatgcca aaaaagattt tgatgaaaag gcggcctatt 1380

ctttagttca aaaagaaagc ttgtttgctg gattaaaagt agaggtggat attcatcaac 1440

gttggatgat tattgagtca aatgcaggtg tggaatttaa tcaaccactt ggcagatgtg 1500

tgtaccttca tcacgtcgat aatattgagc aaatattgcc ttatgttcaa aaaaataaga 1560

cgcaaaccat atctattttt ccttgggagt catcatttaa atatcgagat gcgttagcat 1620

taaaaggtgc ggaaaggatt gtagaagcag gaatgaataa catatttcga gttggtggat 1680

ctcatgacgg aatgagaccg ttgcaacgat tagtgacata tatttctcat gaaaggccat 1740

ctaactatac ggctaaggat gttgcggttg aaatagaaca gactcgattc ctggaagaag 1800

ataagttcct tgtatttgtc ccataatagg taaaagtatg gaaaatgaat caaaatataa 1860

aaccatcgac cacgttattt gtgttgaagg aaataaaaaa attcatgttt gggaaacgct 1920

gccagaagaa aacagcccaa agagaaagaa tgccattatt attgcgtctg gttttgcccg 1980

caggatggat cattttgctg gtctggcgga atatttatcg cggaatggat ttcatgtgat 2040

ccgctatgat tcgcttcacc acgttggatt gagttcaggg acaattgatg aatttacaat 2100

gtctatagga aagcagagct tgttagcagt ggttgattgg ttaactacac gaaaaataaa 2160

taacttcggt atgttggctt caagcttatc tgcgcggata gcttatgcaa gcctatctga 2220

aatcaatgct tcgtttttaa tcaccgcagt cggtgttgtt aacttaagat attctcttga 2280

aagagcttta gggtttgatt atctcagtct acccattaat gaattgccgg ataatctaga 2340

ttttgaaggc cataaattgg gtgctgaagt ctttgcgaga gattgtcttg attttggttg 2400

ggaagattta gcttctacaa ttaataacat gatgtatctt gatataccgt ttattgcttt 2460

tactgcaaat aacgataatt gggtcaagca agatgaagtt atcacattgt tatcaaatat 2520

tcgtagtaat cgatgcaaga tatattcttt gttaggaagt tcgcatgact tgagtgaaaa 2580

tttagtggtc ctgcgcaatt tttatcaatc ggttacgaaa gccgctatcg cgatggataa 2640

tgatcatctg gatattgatg ttgatattac tgaaccgtca tttgaacatt taactattgc 2700

gacagtcaat gaacgccgaa tgagaattga gattgaaaat caagcaattt ctctgtctta 2760

aaatctattg agatattcta tcactcaaat agcaatataa ggactctcta tgaaatttgg 2820

aaactttttg cttacatacc aacctcccca attttctcaa acagaggtaa tgaaacgttt 2880

ggttaaatta ggtcgcatct ctgaggagtg tggttttgat accgtatggt tactggagca 2940

tcatttcacg gagtttggtt tgcttggtaa cccttatgtc gctgctgcat atttacttgg 3000

cgcgactaaa aaattgaatg taggaactgc cgctattgtt cttcccacag cccatccagt 3060

acgccaactt gaagatgtga atttattgga tcaaatgtca aaaggacgat ttcggtttgg 3120

tatttgccga gggctttaca acaaggactt tcgcgtattc ggcacagata tgaataacag 3180

tcgcgcctta gcggaatgct ggtacgggct gataaagaat ggcatgacag agggatatat 3240

ggaagctgat aatgaacata tcaagttcca taaggtaaaa gtaaaccccg cggcgtatag 3300

cagaggtggc gcaccggttt atgtggtggc tgaatcagct tcgacgactg agtgggctgc 3360

tcaatttggc ctaccgatga tattaagttg gattataaat actaacgaaa agaaagcaca 3420

acttgagctt tataatgaag tggctcaaga atatgggcac gatattcata atatcgacca 3480

ttgcttatca tatataacat ctgtagatca tgactcaatt aaagcgaaag agatttgccg 3540

gaaatttctg gggcattggt atgattctta tgtgaatgct acgactattt ttgatgattc 3600

agaccaaaca agaggttatg atttcaataa agggcagtgg cgtgactttg tattaaaagg 3660

acataaagat actaatcgcc gtattgatta cagttacgaa atcaatcccg tgggaacgcc 3720

gcaggaatgt attgacataa ttcaaaaaga cattgatgct acaggaatat caaatatttg 3780

ttgtggattt gaagctaatg gaacagtaga cgaaattatt gcttccatga agctcttcca 3840

gtctgatgtc atgccatttc ttaaagaaaa acaacgttcg ctattatatt agctaaggag 3900

aaagaaatga aatttggatt gttcttcctt aacttcatca attcaacaac tgttcaagaa 3960

caaagtatag ttcgcatgca ggaaataacg gagtatgttg ataagttgaa ttttgaacag 4020

attttagtgt atgaaaatca tttttcagat aatggtgttg tcggcgctcc tctgactgtt 4080

tctggttttc tgctcggttt aacagagaaa attaaaattg gttcattaaa tcacatcatt 4140

acaactcatc atcctgtcgc catagcggag gaagcttgct tattggatca gttaagtgaa 4200

gggagattta ttttagggtt tagtgattgc gaaaaaaaag atgaaatgca tttttttaat 4260

cgcccggttg aatatcaaca gcaactattt gaagagtgtt atgaaatcat taacgatgct 4320

ttaacaacag gctattgtaa tccagataac gatttttata gcttccctaa aatatctgta 4380

aatccccatg cttatacgcc aggcggacct cggaaatatg taacagcaac cagtcatcat 4440

attgttgagt gggcggccaa aaaaggtatt cctctcatct ttaagtggga tgattctaat 4500

gatgttagat atgaatatgc tgaaagatat aaagccgttg cggataaata tgacgttgac 4560

ctatcagaga tagaccatca gttaatgata ttagttaact ataacgaaga tagtaataaa 4620

gctaaacaag agacgcgtgc atttattagt gattatgttc ttgaaatgca ccctaatgaa 4680

aatttcgaaa ataaacttga agaaataatt gcagaaaacg ctgtcggaaa ttatacggag 4740

tgtataactg cggctaagtt ggcaattgaa aagtgtggtg cgaaaagtgt attgctgtcc 4800

tttgaaccaa tgaatgattt gatgagccaa aaaaatgtaa tcaatattgt tgatgataat 4860

attaagaagt accacatgga atatacctaa tagatttcga gttgcagcga ggcggcaagt 4920

gaacgaatcc ccaggagcat agataactat gtgactgggg tgagtgaaag cagccaacaa 4980

agcagcagct tgaaagatga agggtataaa agagtatgac agcagtgctg ccatactttc 5040

taatattatc ttgaggagta aaacaggtat gacttcatat gttgataaac aagaaattac 5100

agcaagctca gaaattgatg atttgatttt ttcgagcgat ccattagtgt ggtcttacga 5160

cgagcaggaa aaaatcagaa agaaacttgt gcttgatgca tttcgtaatc attataaaca 5220

ttgtcgagaa tatcgtcact actgtcaggc acacaaagta gatgacaata ttacggaaat 5280

tgatgacata cctgtattcc caacatcggt ttttaagttt actcgcttat taacttctca 5340

ggaaaacgag attgaaagtt ggtttaccag tagcggcacg aatggtttaa aaagtcaggt 5400

ggcgcgtgac agattaagta ttgagagact cttaggctct gtgagttatg gcatgaaata 5460

tgttggtagt tggtttgatc atcaaataga attagtcaat ttgggaccag atagatttaa 5520

tgctcataat atttggttta aatatgttat gagtttggtg gaattgttat atcctacgac 5580

atttaccgta acagaagaac gaatagattt tgttaaaaca ttgaatagtc ttgaacgaat 5640

aaaaaatcaa gggaaagatc tttgtcttat tggttcgcca tactttattt atttactctg 5700

ccattatatg aaagataaaa aaatctcatt ttctggagat aaaagccttt atatcataac 5760

cggaggcggc tggaaaagtt acgaaaaaga atctctgaaa cgtgatgatt tcaatcatct 5820

tttatttgat actttcaatc tcagtgatat tagtcagatc cgagatatat ttaatcaagt 5880

tgaactcaac acttgtttct ttgaggatga aatgcagcgt aaacatgttc cgccgtgggt 5940

atatgcgcga gcgcttgatc ctgaaacgtt gaaacctgta cctgatggaa cgccggggtt 6000

gatgagttat atggatgcgt cagcaaccag ttatccagca tttattgtta ccgatgatgt 6060

cgggataatt agcagagaat atggtaagta tcccggcgtg ctcgttgaaa ttttacgtcg 6120

cgtcaatacg aggacgcaga aagggtgtgc tttaagctta accgaagcgt ttgatagttg 6180

aggatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct 6240

ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg 6300

agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc 6360

atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg 6420

ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc cttgagagcc 6480

ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg 6540

actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg ggtcattttc 6600

ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga 6660

atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag 6720

aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt gctggcgttc 6780

gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg 6840

atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt 6900

caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct gatcgtcacg 6960

gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc 7020

ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctcgacc 7080

tgaatggaag ccggcggcac ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt ggagccaatc 7140

aattcttgcg gagaactgtg aatgcgcaaa ccaacccttg gcagaacata tccatcgcgt 7200

ccgccatctc cagcagccgc acgcggcgca tctcgggcag cgttgggtcc tggccacggg 7260

tgcgcatgat cgtgctcctg tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt tgccttactg 7320

gttagcagaa tgaatcaccg atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc tgcaaaacgt 7380

ctgcgacctg agcaacaaca tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa agtctggaaa 7440

cgcggaagtc agcgccctgc accattatgt tccggatctg catcgcagga tgctgctggc 7500

taccctgtgg aacacctaca tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc tgagtgattt 7560

ttctctggtc ccgccgcatc cataccgcca gttgtttacc ctcacaacgt tccagtaacc 7620

gggcatgttc atcatcagta acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc atcggtatca 7680

ttacccccat gaacagaaat cccccttaca cggaggcatc agtgaccaaa caggaaaaaa 7740

ccgcccttaa catggcccgc tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg gagaaactca 7800

acgagctgga cgcggatgaa caggcagaca tctgtgaatc gcttcacgac cacgctgatg 7860

agctttaccg cagagaccat gacctaaagc aagaattttc aagccttgct aagactgttg 7920

atcggtcggg ggcgcagcta atccgtgact tcatgcgtga ctttgttaag aagcaacagg 7980

aagccgcaga ctatgacaaa tggttcaagc agcaggtaca gatcggctta aatgaagcca 8040

atgcaggcaa gttgattcca catgaggacg taaaggcaga gtttgccgct agacgtgctg 8100

caacattggc gaaactggca gcgaagaatg aagattgagt ggactgaaac agctcgccaa 8160

gatcgtagaa atatctatga ttatcttgaa gaacgcaacc ctatagcagc tattgaaatt 8220

gatgatttaa ttgaagaaaa gacagattta cttgttgata atcgactgat ggggcgcaca 8280

ggcagacaga aagatactag ggagttagtg atacatccgc attatgtggt tgtatatgac 8340

atcactgata taatacggat actcagagtg ctacacacat cgcaggagtg gtcatgactt 8400

actcatgtac tttggattat ttagtgttat aaaatcctga tttataaatt ttttttgtta 8460

aaaaagataa aagccccttg caattgcttg gggctttacc gtaatttatg gggtacagat 8520

cttcgatact gacatatcgg caatcgaaag cattaangtt tgacgaccgc taatgatttc 8580

accacanggg cttaatgtac ctgtcttaaa ttctaaggtt ttaactcgct ttgtcaagca 8640

tagaccccaa aaatttagcc aatgtctgta actcaatctg tccatgtgtg ggtgatgagg 8700

tacagtgacg ctagcacaca tcggaaaaac gctattacta ggggaactga acagagtagc 8760

ggacgcaatg agtagtcatt taattggcgg ttatgagcgt gttcaggcgg tgctatcaat 8820

cgtaatcata acagtggcag cttgatacag tgatgtcatc cctgatgcga aagcgaccga 8880

ccgacggtac atcgaatggg aatactttag ggtgattttt aagaatcgct ctagggtgag 8940

tatttcccat tcagctctgc tccctccctc tggtacttta atcaaaagca ctactaaaca 9000

tatgttttta aataaaaaat attgatatag agataatatt agtaagaata attaaacaat 9060

tgaatataga taaatcattg ttaaataaag attaattatt aaaatgaatg tatacttata 9120

tataaatcaa tgatttaaaa tatttgataa agaaaacttt tcaaaaaaaa tataattgag 9180

attgtgtcat ttcggtcaat tcttaatatg ttccacgcaa gttttagcta tggtgctaaa 9240

cagaaatttg ctgaaaaaga acttttcact gaactggtta aaatgtaagc agcntgagag 9300

ccgccaaaaa ttttaaaaac aaaccgcctt aatcatcttc aaaaaatacc tctaaaacct 9360

caccatttgc gttttaagac ccatatttca tcctgccctt atgttcccat gctgatagct 9420

ataaagtgtc tgtaatcgct tcctatgacg ttntaggctg ttgataactt ttggaacaac 9480

gcaaaatgtt aaaatccgat cattttttaa cctagttatt ttcgttacag ggtaactttg 9540

gtagtattat ttcaatattt agttgttaca ggataacaaa atatatgtta cagggtaatt 9600

aatttagcgt tacaggataa ctatagttac agggtaacgt taaatagtta tcctgtaatt 9660

taaaaatagt tgcaggatag cataaatttt tacaaataaa ttttataaaa agttatcctg 9720

taactaaaaa caatgttatc ctgtaactat gatatactat atgggagtta aagacatgaa 9780

agacccgaac gatcagaaaa cacaggacat gctaaaagag ccgccaaaaa ccaatgccga 9840

acgacaaaaa gcatatcgtg aaaaacgcaa aagccttgat agtcctgcct cgcgcgtttc 9900

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 9960

taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 10020

cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg 10080

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 10140

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 10200

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 10260

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 10320

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 10380

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 10440

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 10500

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 10560

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 10620

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 10680

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 10740

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 10800

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 10860

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 10920

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 10980

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 11040

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 11100

ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 11160

gttcatccat agttgcctga ctccccgtct ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc 11220

aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac 11280

caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 11340

attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 11400

gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 11460

aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 11520

agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc 11580

aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 11640

tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 11700

aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 11760

atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa 11820

ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 11880

cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 11940

tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga 12000

ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 12060

taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt 12120

actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat 12180

gtaacatcag agattttgag acacaacgtg gctttccccc ccccccctgc aggtcgacgg 12240

gcccggtacc gcggccgcct taagacgcgt ggatcggatc agacgtctaa gaaaccatta 12300

ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt cttcaa 12356