一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种能够催化白桦脂醇转化生 成白桦脂酸的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 白桦脂酸（Betulinic acid，简称BA)是一类五环羽扇烷型的三萜化合物。对许多 特定的肿瘤细胞如黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等、不同类型的例如人类免疫缺陷病 毒、疟疾和细菌等感染剂和一般的炎性过程具有选择性细胞毒性。最近，大量的体内外实验 证明白桦脂酸还具有其他临床功能。白桦脂酸可以减缓乙醇诱导的肝星状细胞的激活，通 过抑制肝葡萄糖的产生来缓解高血糖症，增强免疫应答，通过抑制胰脂肪酶达到减肥的效 果，还可以保护心肌免受由于缺血再灌注引起的损伤以及有助于治疗化学性的甲状腺功能 低下症。
[0003] 目前BA的制备方法，主要有以下三种：1直接提取法，2化学合成法，3微生物转化 法。目前，白桦脂酸植物提取的主要来源是白桦树皮，但其中BA含量很低，仅为0. 025%~ 2 %。白桦脂酸早在1938年已被化学合成，均是以白桦脂醇为原料，经过一系列氧化还原 反应最终生成白桦脂酸。目前，化学合成法制备白桦脂酸较多地应用于生产实践中，虽然 合成效果较好，但存在操作复杂、污染大、合成成本高、安全性低等问题，限制了其在实际中 的应用，有待进一步改善提高。微生物转化是通过微生物整体细胞或酶将复杂的底物进行 结构修饰，也就是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化反应， 因为其具有直接提取和化学合成法所不具有的方便、绿色、成本低等优点，在近年来获得了 广泛关注。目前有几种真菌已被证实可以完成白桦脂醇到白桦脂酸的转化，分别为黄绿蜜 环菌（Armillaria luteo-virens Sacc)ZJUQH100_6,短刺小克银汉霉（Cunninghamella blakesleeana)，臭曲霉（Aspergillus foetidus)ZU-G1 和米曲霉（Aspergillus oryzae)AS 3. 498,但产率仍然不能满足商业化需求。
[0004][0005] 代谢工程和合成生物学的快速发展为在微生物宿主内获得高产的天然产物提供 了很好的解决方法，但现在很少有将这些技术应用到白桦脂醇的转化方面的研究。白桦脂 醇转化生成白桦脂酸是C28位的羟基氧化为羧基，可通过基因工程的手段将具有C28位氧 化功能的基因与相应的还原酶基因导入酿酒酵母完成转化。目前，已发现的具有C-28位 氧化功能的基因有来自漠藜状苜蓿（Medicago truncatula)的CYP716A12,葡萄（Vitis vinifera)的 CYP716A15,人参（Panax ginseng)的 CYP716A52v2 和长春花（Catharanthus roseus)的 CYP716AL1。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种重组酿酒酵母，该重组酿酒酵母表达的微粒体蛋白能够催化白 桦脂醇转化成白桦脂酸。
[0007] -种重组酿酒酵母，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)W303_lb，保藏 在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏时间：2015年11月5日，保藏编 号：CCTCC NO :M 2015662。
[0008] 本发明构建的重组酿酒酵母含有蒺藜状苜蓿CYP716A12基因和拟南芥ATRl基因， 能够同时表达CYP716A12氧化酶和ATRl还原酶，提取此重组酿酒酵母表达的微粒体蛋白， 将此微粒体蛋白加入到白桦脂醇转化体系中，能够催化白桦脂醇转化成白桦脂酸。
[0009] 本发明酿酒酵母采用的表达载体为酿酒酵母多基因共表达载体pESC-ura (图1)， 该载体含有两个半乳糖启动子GALl和GAL10,可以分别启动表达两个基因。
[0010] 本发明还提供了一种重组酿酒酵母的构建方法，包括以下步骤：
[0011] (1)将蒺藜状苜蓿 CYP716A12 基因插入 pESC-ura，得到 pESC-ura-CYP716A12 ;
[0012] (2)将拟南芥 ATRl 基因插入 pESC-ura-CYP716A12，获得 pESC-ura-CYP716A12-ATRl ；
[0013] (3)将pESC-ura-CYP716A12-ATRl转入酿酒酵母细胞，获得所述重组酿酒酵母。
[0014] 在本发明实施中记载，蒺藜状苜蓿CYP716A12基因插入pESC-ura的其中一个半乳 糖启动子GALl的下游；拟南芥ATRl基因插入位置为半乳糖启动子GALlO的下游，以实现双 表达。
[0015] 所述蒺藜状苜蓿CYP716A12基因的GenBank号为：DQ335781. 1 ;所述拟南芥ATRl 基因的 GenBank 号为：NM_118585. 3〇
[0016] 本发明还提供了利用所述重组酿酒酵母制备微粒体蛋白的方法，包括以下步骤：
[0017] ⑴接种；
[0018] ⑵培养，收集菌体细胞；
[0019] (3)将菌体细胞破碎；
[0020] (4)第一次离心，获得上清液；
[0021] (5)将沉淀剂加入上清液，第二次离心获得沉淀，即为所述的微粒体蛋白。
[0022] 培养重组酿酒酵母的培养基可使用YPAD。培养完成后，使用离心法收集上清。
[0023] 菌体细胞破碎方法可以是加玻璃珠震荡破碎、超声破碎或者使用高压细胞破碎仪 破碎。破碎时将菌体重悬于适当缓冲液中，缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、MES 缓冲液或者HEPES缓冲液。
[0024] 所述沉淀剂用于将上清液中蛋白通过盐析沉淀，沉淀过程不会导致酶失活，可以 选用MgCl 2、CaCl2、（NH4)2SO4S它们的混合物，最优选为MgCl 2。
[0025] 离心的条件最终影响微粒体蛋白的活性，第一次离心的条件优选为：4000~ 8000g离心5~30min ;第二次离心的条件优选为：8000~15000g离心30~120min。
[0026] 本发明提供了所述方法制备得到的微粒体蛋白。
[0027] 该微粒体蛋白为混合物，具体组分没有测定，但可以确定包含CYP716A12氧化酶 和ATRl还原酶。
[0028] 本发明提供了所述的微粒体蛋白在转化白桦脂醇生成白桦脂酸中的应用，包括以 下步骤：
[0029] 将所述白桦脂醇加入含有所述微粒体蛋白的缓冲体系中，反应完成后，分离纯化 得到所述白桦脂酸。
[0030] 所述反应中白桦脂醇浓度为60~100 ymol/L，优选为80 ymol/L ;微粒体蛋白浓 度为1~2mg，优选为I. 5mg ;NADPH浓度为0~2mM，优选为2mM ;缓冲液可以选择磷酸钠缓 冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液，优选为磷酸钠缓冲液；缓冲液浓度为50~200mM，优选 为IOOmM ;缓冲液pH为7. 0~8. 0,优选为7. 5 ;反应温度为25~32°C，优选为30°C ;反应 时间为3~9h，优选为6h。
[0031] 分离纯化白桦脂酸使用有机溶剂萃取，然后通过旋转蒸发或者通风放置使其自行 挥发去除所使用的有机溶剂。所述有机溶剂可以是乙醇、乙二醇、乙酸乙酯或他们的混合 物，最优选为乙酸乙酯。，
[0032] 本发明中白桦脂醇、白桦脂酸含量同步检测方法为：使用高效液相色谱（HPLC)检 测法检测。色谱柱为反向(318柱（?11611〇1]161161，250\4.61111]1)，流动相为乙腈/水（体积比） =91/9,流速为lmL/min，柱温为40°C，检测波长为210nm。
[0033] 相对于现有的植物提取工艺，本发明利用微粒体蛋白转化白桦脂醇生成白桦脂 酸，操作简单、易于控制，安全性高、成本低，转化条件温和、转化效率高，而且周期短，适用 于商业化生产。
【附图说明】
[0034] 图 1 为 pESC-ura-CYP716A12-ATRl 质粒构建示意图；
[0035] 图2为线性表示的pESC-ura-CYP716A12-ATRl质粒构建示意图；
[0036] 图3为白桦脂醇转化白桦脂酸反应结束后，所得产物的HPLC结果图。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说 明，均可从商业途径得到。
[0038] 实施例 lpESC-ura-CYP716A12-ATRl 质粒构建
[0039] (1)CYP716A12和ATRl基因序列的获得
[0040] 以中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所王彦章老师提供的来源 于蒺藜状苜蓿生长四周的叶子的总DNA为模板，用引物C-F (引物序列见表1，下同）和C-R 扩增0￥?716412基因，扩增条件为：95°(：预变性31