基于CRISPR/Cas9和酿酒酵母细胞内源的同源重组的分子克隆方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新的分子克隆方法，具体而言，涉及通过组合利用CRISPR/Cas9 系统和酿酒酵母细胞内源的同源重组系统对初始载体进行改造，以获得重组载体的方法， 所述方法仅通过一次转化筛选操作，即可同时完成将一个或多个目的DNA片段插入初始载 体、从初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将载体上的一个或多个DNA片段替换为 一个或多个目的DNA片段。本发明还涉及用于方便有效地实施本发明所述的分子克隆方法 的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 分子克隆是将目的DNA片段与载体DNA组装为重组载体后导入宿主细胞或生物 体，使其在宿主内复制的分子生物学实验方法。在宿主细胞扩增过程中，带有目的DNA片段 的重组载体能够作为宿主基因组的一部分或者独立地复制，从而被后代细胞继承。通过这 样的方式，能够获得带有所述目的DNA片段的细胞群体，从而实现从单个目的DNA片段获得 大量完全相同的目的DNA片段。这一过程即克隆过程。其中，所述目的DNA可来源于对宿 主而言为同源或异源的生物体，或者为人工序列。分子克隆技术作为现代生物学的核心技 术，被广泛地用于测序、遗传工程、蛋白纯化、生物制药等各方面。
[0003] 在传统的分子克隆技术中，一般利用"酶切-连接"的方式将目的DNA与载体进行 连接：首先通过限制性酶切在目的DNA和载体DNA上制造互补的黏性末端或者平末端，再用 连接酶将二者连在一起，生成带有目的DNA的载体，也称为重组载体（Nathans D.等，1975， Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules， Annu. Rev. Biochem. 44 :273 - 93)。限制性内切酶特异性地识别靶DNA序列（即酶切位点）。 因此，为了能够对多个目的DNA片段进行操作，常用的工程化及商业化的载体通常具有多 克隆位点，且针对目的DNA片段的操作（例如插入、替换和/或删除）大多在多克隆位点处 进行。在实践中，对目的DNA的每次操作都需要进行一系列的酶切连接、转化和筛选步骤， 该过程需要数天时间。此外，常常发生需要操作的位置没有酶切位点、或希望使用的限制性 内切酶在载体或目的片段上存在多个靶点的情况，此时需要更多的时间和更繁琐的步骤对 载体进行改造。当需要将多个片段连入载体时，传统的分子克隆技术费时耗力且成本极高。
[0004] 作为改进，基于酶切-连接的Biobrick方法利用同尾酶实现片段的逐级组装 (Sleight S.C.等，In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering. Nucleic Acids Res，2010,38(8) :2624-36)。该方法仅使用4个限制性内切酶EcoRI、XbaI、SpeI以及PstI 即可完成任意数量片段的组装，省去了挑选合适的限制性内切酶的复杂过程。然而，每操 作一个片段仍需要进行一系列的酶切连接、转化和克隆筛选。该方法不能同时实现多个片 段的拼接。目前最有效的DNA操作方法为Gibson拼接（Gibson Assembly)。该方法的原 理在于，将20~80bp的短重叠序列添加至各待连接的片段（例如需要首尾相连的多个 DNA片段）的末端，重叠序列的设置用于保证各片段的组装顺序。在50°C的孵育温度下， Gibson拼接混合物中的DNA外切酶从5'端降解部分核苷酸产生黏性末端，从而待拼接的两 相邻片段的重叠区之间可以通过退火而互补，然后在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下将 缺口补齐，形成完整的双链DNA，实现无痕拼接（Gibson, D.G.等，Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods 6,343-345,2009)〇 Gibson拼接技术不区分载体片段和目的片段，其优势在于简便快速、能直接使用PCR片段、 不需要回收步骤、且可以处理多个片段。然而，传统的Gibson拼接方法对片段大小要求严 格。例如，小于l〇〇bp的片段不能正确拼接。另外，当片段数增多时，正确拼接效率下降。
[0005] 最近报道了组合利用CRISPR/Cas9系统和Gibson拼接的体外克隆方法。以色列 专利申请62043公开了一种大基因簇钓取方法（CATCH)，该方法包含如下步骤：将细菌包埋 到琼脂块中，经过溶菌酶、蛋白酶K处理后，将所述琼脂块与包含Cas9蛋白、预先设计的针 对抓取位点的sgRNA对及缓冲液混合，孵育2小时，使得琼脂块中酶充分扩散且基因组DNA 被充分酶切；通过脉冲场电泳分离目的片段并纯化，随后利用Gibson拼接，将被钓取的大 片段DNA连入BAC载体。类似地，Jia-Wang Wang等提出了组合利用CRISPR/Cas9核酸酶 酶切与Gibson拼接的无缝克隆方法。该方法首先利用CRISPR/Cas9将载体线性化，随后在 Gibson拼接系统中将线性化的载体与一个编码青色荧光蛋白的DNA片段（853bp)孵育，获 得Gibson拼接产物。将Gibson拼接产物转化入大肠杆菌，并筛选阳性克隆（Wang J-W.等， 2015， CRISPR/Cas9nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning，BioTechniques 58:161-170. doi 10. 2144/000114261)。然而，这些方法并未提及 是否可同时对多个目的片段进行操作，也未考虑多片段拼接的效率问题。
[0006] 目前，本领域还未提出利用CRISPR/Cas9系统作为分子生物学工具，针对载体上 的多个靶点或针对多个目的DNA片段进行操作的体外分子克隆方法。
【发明内容】
[0007] -方面，本发明提供了一种分子克隆方法，所述方法通过将一个或多个目的DNA 片段插入初始载体、从初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将所述初始载体上的一 个或多个DNA片段替换为目的DNA片段，获得重组载体，所述方法包含如下步骤：
[0008] (1)定位：针对初始载体上待实施插入、删除和/或替换的的各个位点，设计并通 过体外转录合成单导向RNA (single-guide RNA，sgRNA);
[0009] (2)酶切：在体外利用Cas9核酸酶和步骤（1)获得的sgRNA对所述初始载体进行 酶切，使得所述待实施插入、删除和/或替换的各个位点处的DNA双链断裂，对酶切后的各 初始载体片段进行回收和纯化；
[0010] (3)制备同源臂序列：针对待连接的各相邻片段，制备用于酿酒酵母同源重组的 同源臂序列，所述同源臂序列位于第一待连接片段和/或第二待连接片段的侧翼，或者所 述同源臂序列以同源臂片段的形式单独存在；
[0011] (4)连接和转化：将步骤⑶制备的所述同源臂序列、步骤⑵获得的所述初始载 体片段以及任选的所述目的DNA片段转化入酿酒酵母细胞；
[0012] (5)筛选和获得重组载体：筛选出带有所述重组载体的酿酒酵母细胞阳性克隆， 从而获得带有重组载体的酿酒酵母细胞，
[0013] 其中，所述重组载体为能够在所述酿酒酵母细胞中复制的载体。
[0014] 另一方面，本发明还提供了用于方便有效地实施本发明所述的分子克隆方法的试 剂盒，所述试剂盒包含独立包装的sgRNA克隆载体、Cas9核酸酶以及酿酒酵母细胞。
[0015] 有益效果
[0016] 本发明的方法组合利用CRISPR/Cas9和酿酒酵母内源的同源重组系统替代传统 的"酶切"和"连接"，仅通过一次转化筛选，即可在初始载体的任意位置实现将一个或多个 目的DNA片段插入初始载体、从初始载体上删除一个或多个DNA片段和/或将载体上的一 个或多个DNA片段替换为一个或多个目的DNA片段。特别地，针对某一待实施插入的位点 而言，可同时插入一个或多个目的DNA片段。这是第一次在体外实现同时针对多个位点、对 多个DNA片段进行多种操作的一步克隆方法。
[0017] 具体而言，Cas9核酸酶的作用位点完全取决于所设计的sgRNA序列。由于sgRNA 通常为约20bp，远大于限制性内切酶所识别的6-8bp的序列，因此特异性大大提高。并且， 由于可针对任意的DNA序列设计所匹配的sgRNA，因此能够针对载体的任何位点实施操作。 利用CRISPR/Cas9使得初始载体的一个或多个位点发生双链断裂便于对初始载体进行片 段化处理，从而在随后的同源重组过程中，能够在同源臂序列的指引下，将一个或多个载体 片段与任选的目的片段按顺序拼接。通过这样的方式，能够同时针对多个待操作位点实施 插入、删除和/或替换。
[0018] 另一方面，本发明利用酿酒酵母内源的高效的同源重组系统，使得多片段的连接 和转化同时完成。其中，同源臂可位于第一待连接片段和/或第二待连接片段侧翼，或者以 同源臂片段（寡核苷酸片段）的形式单独存在，无论待连接片段来自于PCR产物、酶切产物 还是人工合成序列，以如上任一种方式设置的同源臂都能保证各待连接片段的顺序连接， 从而方便地实施连接和转化操作。由于本发明方法中的连接和转化步骤利用酿酒酵母细胞 内源的同源重组系统，要求重组载体带有酿酒酵母的复制起始位点，以允许重组载体在酵 母细胞内复制。然而，重组载体也可带有允许在其它宿主内复制的其它复制起始位点。在 这种情况下，所构建的重组载体为能够在两种以上宿主中复制的穿梭质粒。通过这样的方 式，本发明的方法可用于构建针对更宽的宿主范围的载体。
[0019] 特别地，在优选实施方式中，待实施插入、删除和/或替换的一个或多个DNA片段 可以编码与抗生素抗性、营养缺陷筛选和/或宿主特异性复制起始位点相关的基因。从而 与初始载体相比，重组载体的抗性、营养缺陷性质和/或允许其复制的宿主发生改变。例 如，通过将初始载体上的一种抗生素抗性或营养缺陷筛选相关基因替换为另一抗生素抗性 或营养缺陷筛选相关基因，能够显著提高本发明方法的阳性率。
【附图说明】
[0020] 图1为根据本发明方法的步骤（3)中同源臂序列设置的示意图。对于一个待操作 位点而言，同源臂序列可以位于待连接片段中其中一个的侧翼（a)、位于各待连接的片段的 侧翼（b)或者以同源臂片段的形式单独存在（c)。
[0021] 图2为本发明实施例中使用的初始载体pHY-wt的质粒图谱。
[0022] 图3为根据本发明实施例1-12,对初始载体的多个靶点进行如下操作的示意图 (为方便描述，以编号I-V表示待操作的各位点，以编号1-9表示各片段）：将位点I和位 点II之间的ura3替换为trpl，在位点III、IV和V处分别插入片段7(lacZ片段）、片段 8 (mRFP片段）以及片段9 (Apr片段）。
[0023] 图4为对本发明实施例1-3获得的克隆进行菌落PCR后利用琼脂糖凝胶电泳进行 分析的结果。Μ为DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道为利用表3所 示的引物，对随机挑选的20个克隆进行菌落PCR后琼脂糖凝胶电泳的结果。
[0024] 图5为对本发明实施例4-6获得的克隆进行菌落PCR后利用琼脂糖凝胶电泳进行 分析的结果。Μ为DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道为利用表3所 示的引物，对随机挑选的20个克隆进行菌落PCR后琼脂糖凝胶电泳的结果。
[0025] 图6为对本发明实施例7-9获得的克隆进行菌落PCR后利用琼脂糖凝胶电泳进行 分析的结果。Μ为DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道为利用表3所 示的引物，对随机挑选的20个克隆进行菌落PCR后琼脂糖凝胶电泳的结果。
[0026] 图7为对本发明实施例10-12获得的克隆进行菌落PCR后利用琼脂糖凝胶电泳进 行分析的结果。Μ为DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道为利用表3 所示的引物，对随机挑选的20个克隆进行菌落PCR后琼脂糖凝胶电泳的结果。
【具体实施方式】 [0027] 分子克隆方法
[0028] 如上所述，本发明的方法组合利用了 CRISPR/Cas9和酿酒酵母内源的同源重组系 统，首先在体外利用sgRNA导向的Cas9核酸酶在初始载体的待实施插入、删除和/或替换 的一个或多个位点制造双链断裂，将全部片段纯化回收，获得初始载体各片段；随后将获得 的初始载体片段、同源臂序列和任选的目的DNA片段共同转化入酿酒酵母，利用酿酒酵母 自身的同源重组系统将各片段顺序连接，在理想情况下，转化子含有各片段均按顺序连接 的重组载体；最后筛选带有重组载体的阳性克隆。利用本发明的方法，能够仅通过一步转化 筛选操作，将一个或多个目的DNA片段插入初始载体、从初始载体上删除一个或多个DNA片 段和/或将载体上的一个或多个DNA片段替换为一个或多个目的DNA片段。所述一个或多 个目的DNA片段可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上DNA 片段，所述待实施插入、删除和/或替换的位点可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、 7个、8个、9个或10个以上位点。在一些实施方式中，能够仅通过一步转化筛选操作，将一 个或多个（例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上）目的DNA片 段插入初始载体的一个或多个（例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10 个以上）位点；将初始载体上一个或多个（例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、 9个或10个以上）位置的片段替换为一个或多个（例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7 个、8个、9个或10个以上）目的DNA片段；和/或将初始载体上一个或多个（例如1个、2 个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上）位置的一个或多个（例如1个、2个、 3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上）待实施删除的片段删除。由于本发明的 方法对初始载体同样采取片段化处理，针对某一插入或替换位点而言，待插入或待替换的 目的DNA片段数量没有特别的限制。在一些实施方式中，可将一个以上（例如1个、2个、3 个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上）目的DNA片段插入同一待插入位点。在一 些实施方式中，可用一个以上（例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个 以上）目的DNA片段替换初始载体上的一个（被替换）片段。
[0029] 本发明中使用的术语"初始载体"是指实施目的片段的插入、替换和/或删除前 的载体。初始载体可为环状质粒或线状载体，例如但不限于宿主特异性质粒、穿梭质粒、 细菌人工染色体（BAC)或酵母人工染色体（YAC)。初始载体也可为克隆载体或表达载 体。作为宿主特异性质粒，初始载体可为仅能在大肠杆菌（Escherichia coli)、链霉菌 (Streptomyces)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)、真菌（fungi)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母 (S. pombe)、毕赤酵母（Pichia membranaefaciens)、哺乳动物细胞（mammalian cells)中复 制的质粒。或者，初始载体可为穿梭质粒，例如大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-链 霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭质粒、 细菌-哺乳动物细胞穿梭质粒、细菌-植物细胞穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌穿梭质粒、 大肠杆菌-链霉菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-丝状真菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆 菌-枯草芽孢杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌-酿酒酵母穿梭质粒、 细菌-哺乳动物-酿酒酵母细胞穿梭质粒或细菌-植物细胞-酿酒酵母穿梭质粒。所述丝 状真菌例如但不限于黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、黄曲霉 (Aspergillus flavus)。在初始载体不能在酿酒酵母中复制的实施方式中，待实施插入和 /或替换的目的片段包含酿酒酵母源复制起始位点。可在两种以上物种中复制的穿梭质粒 或穿梭载体为本领域技术人