核酸扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸扩增方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，因基因利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用基因的医疗受到瞩 目，除此之外，在农业、畜牧业领域也已开发出多种将基因用于鉴别品种、改良品种的方法。 作为用于利用基因的技术，PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)法等核酸 扩增技术正在广泛普及。近年来，开发了能够在短时间内得到核酸扩增反应产物的PCR装 置（例如，专利文献1)。
[0003] 现有技术文献
[0004] 专利文献
[0005] 专利文献1 :日本特开2012-115208
【发明内容】
[0006] 本发明的发明人等在使用了日本特开2012-115208中记载的PCR装置的核酸扩增 反应中，发现如果缩短热变性和退火/延伸时间，则有时核酸扩增效率下降。于是，为了寻 找其原因并解决问题，进行了深入研究，结果发现通过在该PCR装置中使用人工核酸，能够 有效地进行核酸扩增。因此本发明的目的在于提供一种能够高效地核酸扩增的新的核酸扩 增方法。
[0007] 本发明的一个实施方式是一种核酸扩增方法，包含如下工序：将核酸扩增反应容 器的第1区域加热到第1温度的工序，其中，上述核酸扩增反应容器填充有核酸扩增反应液 和与核酸扩增反应液相比比重小且不与核酸扩增反应液混和的液体；将核酸扩增反应容器 的第2区域加热到比上述第1温度低的第2温度的工序；将第1配置切换到第2配置的工 序，其中，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于第2区域的下方，第2配置为第2 区域在重力作用的方向位于第1区域的下方；以及，将第2配置切换到第1配置的工序；并 且，核酸扩增反应液含有探针，探针含有人工核酸。探针与仅含有天然核酸的探针相比，可 以与模板核酸的结合力更大。人工核酸可以为LNA、3' -氨基-2'，4' -BNA、2'，4' -BNAC0C、 2'，4'-8熟％、？嫩、6熟或了嫩。人工核酸可以是1^熟。探针可以是被标记过的探针。标记 过的探针可以是进行了 RI标记、荧光标记或酶标记。
[0008] 本发明的另一实施方式是一种核酸扩增反应装置，该核酸扩增反应装置包含如下 结构：安装部，可安装填充有核酸扩增反应液和与所述核酸扩增反应液相比比重小且不与 所述核酸扩增反应液混和的液体的核酸扩增反应容器；第1加热部，将所述核酸扩增反应 容器的第1区域加热到第1温度；第2加热部，将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到 第2温度；以及，驱动机构，对第1配置和第2配置进行切换，所述第1配置为所述第1区域 在重力作用的方向位于所述第2区域的下方，所述第2配置为所述第2区域在重力作用的 方向位于所述第1区域的下方；并且，核酸扩增反应液含有探针，探针含有人工核酸。
[0009] 根据本发明，可提供一种能够有效地进行核酸扩增的新的核酸扩增方法。
【附图说明】
[0010] 图1是本发明的一个实施方式中使用的核酸扩增反应容器的截面图。g表示重力 方向。
[0011] 图2是本发明的一个实施方式中使用的升降式PCR装置的立体图。（A)表示关闭 盖的状态，（B)表示打开盖的状态。
[0012] 图3是本发明的一个实施方式中使用的升降式PCR装置的主体的分解立体图。
[0013] 图4是示意地表示本发明的一个实施方式中使用的升降式PCR装置的主体的沿图 2㈧的A-A线的截面的截面图。㈧表示第1配置，（B)表示第2配置。
[0014] 图5是表示本发明的一个实施方式和比较例中的表示核酸扩增反应产物量的荧 光亮度测定值与热循环数的关系的图。
【具体实施方式】
[0015] 本发明的目的、特征、优点及其构思根据本说明书的记载对本领域技术人员而言 是明确的，根据本说明书的记载，只要是本领域技术人员，就能容易地再现本发明。以下记 载的发明的实施方式和具体的实施例等表示本发明优选的实施方式，是用于例示或说明而 示出的，本发明不限于这些。在本说明书中公开的本发明的意图和范围内，基于本说明书的 记载，可以进行各种改变和修饰，这对本领域技术人员而言是明确的。
[0016] (1)核酸扩增方法
[0017] 本发明的核酸扩增方法的特征在于，包含如下工序：将核酸扩增反应容器的第1 区域加热到第1温度的工序，其中，上述核酸扩增反应容器填充有核酸扩增反应液和与核 酸扩增反应液相比比重小且不与上述核酸扩增反应液混和的液体；将核酸扩增反应容器的 第2区域加热到比第1温度低的第2温度的工序；将第1配置切换到第2配置的工序，其 中，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于上述第2区域的下方，上述第2配置为 第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方；以及，将第2配置切换到上述第1配置的 工序；并且，核酸扩增反应液含有探针，探针含有人工核酸。
[0018] 核酸扩增反应液可含有核酸扩增反应用试剂和扩增对象的靶核酸。作为靶核酸， 例如，可举出由血液、尿、唾液、脑脊髓液、组织等被检测物制备得到的DNA，或将由这些被检 测物制备得到的RNA进行逆转录的cDNA等。核酸扩增反应用试剂可含有用于扩增靶核酸的 引物对、缓冲液、聚合酶、dNTP、MgCl 2和用于对靶核酸的扩增产物进行检测的荧光标记等。 DNA聚合酶没有特别限定，优选耐热性的酶、PCR用酶，例如，Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚 合酶或者它们的改良型等大量市售品，优选进行热启动的DNA聚合酶。dNTP、盐的浓度只要 为对于使用的酶而言适当的浓度即可，通常可以为如下浓度：使dNTP为10~1000 μΜ，优 选100~500 μ Μ，使Mg2+为1~lOOmM，优选5~10mM，使C1为1~2000mM，优选200~ 700mM，对总离子浓度没有特别限定，可以为高于50mM的浓度，优选高于100mM的浓度，更优 选高于120mM的浓度，进一步优选高于150mM的浓度，进一步优选高于200mM的浓度。上限 优选500mM以下，更优选300mM以下，进一步优选200mM以下。引物用寡聚核苷酸分别使用 0. 1~10 μ M，优选使用0. 1~1 μ M。
[0019] 本发明中，核酸扩增反应液含有包含人工核酸的探针。本说明书中，人工核酸是 指可通过氢键能够与DNA、RNA的碱基键合的天然核酸分子以外的核酸分子。本发明中使 用的人工核酸的种类没有特别限定，但特别优选与仅由天然核酸构成的探针相比，使探针 与互补链的Tm值变高、与模板核酸的结合力提高的人工核酸，优选使核酸的核糖环的2' 位的氧原子与4'位的碳原子进行亚甲基交联的2'，4' -BNA(2' -0,4' -C-甲醇交联核 酸，2' _0,4' -C-methano-bridged nucleic acid，别名 LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid))。以下示出LNA的化学式。 「00201
[0021 ] 上述式中，碱基可举出T (胸腺嘧啶）、C(胞嘧啶）、G(鸟嘧啶）、A(腺嘌呤）、U(尿 嘧啶）、1(肌苷）等作为例子，没有特别限定。也可以是用甲基化、乙酰化等修饰而得到的 碱基。另外，也可以使用对LNA进行修饰而得的LNA类似物，可例示3'氨基-2'，4' -BNA、 2'，4' -BNA·、或 2'，4' 3熟％等。或者使用 PNA(核酸肽，P印tide Nucleic Acid)、 GNA (Glycol Nucleic Acid)、或 TNA(苏糖核酸，Threose Nucleic Acid)、或对它们进行修 饰的类似物。LNA类似物以及PNA、GNA、TNA和它们的类似物也与LNA同样地不限定碱基。
[0022] 探针所含有的人工核酸的数量没有特别限定，可根据靶核酸、探针的排列等而任 意设定。一个探针可以具有多种人工核酸。
[0023] 含有人工核酸的探针优选为了检测靶核酸的扩增而进行了标记。标记的种类没有 特别限定，可以根据目的从TaqMan(注册商标）MGB探针（AppliedBiosystems)等焚光标 记、SYBR Green(注册商标）等嵌入剂、以32P为代表的放射性同位素（RI)等放射性物质标 记、以生物素、异羟基洋地黄毒甙元为代表的酶标记等可得到的标记中任意地选择。含有人 工核酸的探针的制造方法也没有特别限定，可用公知的方法制造。
[0024] 这里，Tm值是指双链的核酸的50%解离成单链的核酸的温度，即解链温度 (Melting Temperature)。Tm值的计算方法没有特别限定，通常可以单独使用或组合使用 GC%法、最邻近喊基对法、或Wallace法进彳丁计算。
[0025] 通过使用含有这样的人工核酸的探针，与使用仅含有天然核酸的探针的情况相 比，扩增的引发更快，在相同的循环数下可更多地得到核酸扩增反应产物，还能够更多地得 到最终产物。换言之，如果将变性温度、退火温度、延伸温度设为一定值，则通过使用含有人 工核酸的探针，与使用了仅含有天然核酸的探针的情况相比，能够在更短时间内得到相同 量的扩增产物。
[0026] 核酸扩增反应液还可以含有表面活性剂。表面活性剂没有特别限定，可例示NP40、 TritonX-100、Tween20等。表面活性剂的浓度没有特别限定，优选不阻碍核酸扩增反应的浓 度，可以为〇· 001 %~〇· 1 %以下，优选为〇· 002 %~0· 02 %，最优选为(λ 005 %~(λ 01 %。 表面活性剂可以从上述的酶的储液带入，也可以与上述的酶的储液相独立地将表面活性剂 溶液添加到核酸扩增反应液。
[0027] 对于液体130,通过使用不与反应液140混和的物质，将反应液140加入容器150 时，反应液140与液体130相分离，因