纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩增检测中的应用
【专利说明】纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩増检测中的应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩增检测中的应用。
[0003]
【背景技术】
[0004]聚合酶链式反应(PCR)是无需使用活生物体而酶促复制DNA的分子生物学技术。PCR在医学和生物研究实验室中普遍用于多种任务，例如检测遗传疾病、鉴定基因指纹、诊断感染性疾病、克隆基因、亲子鉴定和DNA计算。由于其无与伦比的扩增和准确性能力，分子生物学家已将PCR作为核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点或平台期进行DNA检测，这使得难于定量起始模板。实时PCR或动态PCR通过随着反应进程而记录扩增子浓度而提高了终点PCR分析的性能。扩增子浓度最常通过与被扩增靶标相关的荧光信号变化来记录。荧光探针的信号强度直接影响了 PCR检测结果的灵敏性和准确性。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种纳米荧光微粒用作单联或者多联核酸扩增检测试剂盒的用途，该纳米荧光微粒粒径稳定、光谱适用于可见发射光，该纳米荧光微粒通过不同的荧光表达，用于标记在探针碱基两端作为荧光探针标记物，适用于单联或者多联的核酸扩增检测试剂盒。
[0007]为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩增检测中的应用，所述的纳米荧光微粒具有包括内核与外壳的核壳结构，粒径为270~290nm，其内核为包含有荧光分子的聚合物微粒，外壳具有修饰在所述聚合物微粒外表面上的一种或多种官能团，该所述官能团能够直接与配体或生物大分子反应形成微粒表面的共价键连接，或在激活后与配体或者生物大分子进行共价标记；所述的聚合物微粒为聚甲基丙烯酸甲酯的微粒或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微粒或者它们的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯单元的重量至少占所述纳米荧光微粒总重量的50%，所述的荧光分子的重量占所占纳米荧光微粒总重量的0.05°/『5%，所述的纳米荧光微粒与分子探针结合构成荧光探针，用于单联或多联核酸扩增检测。
[0008]在这里，所述的甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物中，所述的甲基丙烯酸甲酯与所述其它单体的结构单元数均大于等于50。所述的其它单体为包括但不限于氟乙稀、氯乙稀、溴乙稀、乙稀碘化、苯乙稀以及丙稀酸等。
[0009]所述的官能团可以为选自羧基，乙醇胺基，羟基，胺基，氨基，亚胺基，环氧基，异氰酸酯基，金属醇盐，及聚乙二醇基中的一种。优选为羧基，在该情况下，其他单体为甲基丙烯酸。
[0010]所述荧光分子指在适当的激发波长下可发射荧光的物质。本发明中，荧光分子优选为荧光素及其衍生物、罗丹明、肾上腺素染料、氟硼莹等。其中，更优选采用罗丹明例如罗丹明Red-X和罗丹明6G等作为荧光分子。荧光分子的重量优选为所述纳米荧光微粒总重量的 0.2%~5%。
[0011]进一步优选地，所述的纳米荧光微粒还包含一种或者一种以上的通过所述官能团共价连接而覆盖在所述纳米荧光微粒表面的生物活性物种，该所述的生物活性物种选自抗体、抗原、核酸、配体、受体、人工多肽、蛋白质以及多糖中的一种。所述的生物活性物种能够参与特异性识别和结合反应，包括特异性结合、核酸杂交和酶反应。生物活性物种可通过一个具有明显亲水性的间隔区域来实现共价标记。这种间隔区域可以是诸如乙烯乙二醇低聚物的小分子间隔区域，也可以是诸如肽、蛋白质、聚乙二醇、和多糖的大分子实体。微粒表面和生物活性种的结合包括氨基键结合，酯键结合，C-C键结合，C-N键结合和包含电荷相互作用的结合。生物活性的例子包括:包含在特定的识别和结合中的分子实体，诸如抗体、抗原、核酸、配体、受体、人工多肽、蛋白质等。该生物活性物种一般都可以采用多种众所周知的技术中的任何一种附着在在表面具有官能团的聚合物微粒上。例如，可以使用羧基、氨基、醛基、硫醛基、环氧基和其它活性或者键和功能基、以及剩余的自由基和阳离子自由基将生物活性物种共价附着在微粒上，同时也实现了蛋白的耦联反应。一个表面官能团可以作为官能共聚单体的一个组合，因为微粒表面可以包含表面浓度相对较高的极性基。此外该发明制备的微粒也可以直接共价键连接蛋白质，而不需要进一步的修改，例如用碳化二亚胺激活微粒表面的羧基，而被激活的羧基与抗体的氨基反应形成酰胺键。激活和抗体耦联可以发生在诸如磷酸(盐)缓冲液，或者2- (N-吗啉)乙烷磺酸的缓冲液中，由此可以形成微粒结合物。
[0012]进一步优选地，所述的纳米荧光微粒是通过以下步骤制得的:
1)、以所述的聚合物微粒和含有所述官能团的烯烃单体为原料，通过微乳液聚合法制备得到外表面上具有所述官能团的聚合物微粒；
2)、向步骤I)所得的外表面上具有所述官能团的聚合物微粒中缓慢注入含有所述荧光分子的有机溶剂和水，聚合物微粒发生溶胀，荧光分子进入聚合物微粒内，然后离心，除去上清液，清洗，加水悬浮，即得所述纳米荧光微粒，其中所述有机溶剂为丙酮或二氯甲烷。
[0013]根据本发明，步骤I)可采用常规的微乳液聚合法来实现，最后获得的聚合物微粒为聚合物、用于提供微粒表面官能团的含有官能团的烯烃单体、表面活性剂、水以及有机溶剂的乳液，这些均为本领域所属技术人员所熟知。
[0014]本发明还提供一种单联或者多联核酸扩增检测试剂盒，包括荧光探针，该所述荧光探针由上述的纳米荧光微粒与分子探针结合而成。
[0015]由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:本发明所使用的纳米荧光微粒采用基于甲基丙烯酸甲酯的聚合物作为封装基体，其使用寿命长，易于制造，制备稳定且具有良好的单分散性，可以很容易地用各种官能团和生物物种对微粒的表面进行改性，每个微粒上都能够被连接上大量的荧光分子，是非常好的荧光信号放大的载体，应用于核酸检测中，可以大大提高检测灵敏度，且纳米荧光微粒非常稳定，受外界影响小，荧光稳定，这为通过荧光进行定量检测提供了良好的条件，因此，本发明纳米荧光微粒是荧光检测技术中高灵敏度分析检测和定量测试中的理想标记。此外，本发明纳米荧光微粒可用可见光光源激发以及通过简单的方法获得，降低检测分析成本。
[0016]本发明的纳米荧光微粒的制备方法简单，获得的纳米荧光微粒中，荧光分子均匀地分布在聚合物微粒中，粒径均匀、稳定，用于制备核酸扩增检测试剂盒，适用于医疗诊断、生物检测、环境检测和食品安全监测以及不同物种的检测技术领域中，具有荧光集团稳定，扩增效率高，荧光强度大，结果稳定可靠等优势。
[0017]
【附图说明】
[0018]附图1、图2为本发明实施例2的纳米荧光微粒的扫描电镜示意图；
附图3~6为本发明核酸扩增检测在四种波长下的检测波形示意图；
附图7为本发明纳米检测探针用于PCR检测与常见荧光物的对比检测波形示意图。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]以下结合具体实施例对上述方案作进一步说明，应理解，这些实施例是用于说明