本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中所采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0021]实施例1表面官能团为羧基的纳米荧光微粒的制备根据本实施例，纳米荧光微粒的制备包括如下步骤:
(I )、制备表面具有羧基的聚甲基丙烯酸甲酯微粒
取Polysciences公司产的聚甲基丙稀酸甲酯微粒(2.7%,0.324 μπι) 5ml，清洗离心后在1ml超纯水中悬浮超声，加入含3mg甲基丙稀酸单体(用于在微粒表面形成羧基)的Iml水，混合2min，加入含15mg聚乙稀醇的0.5ml水，搅拌2min，然后加入含8mg十二烧基硫酸钠的0.5ml水，混合2min，然后加入5ml乙醇，搅拌5min，得到聚甲基丙稀酸甲酯微粒。
[0022](2)、制备纳米荧光微粒
通过注射器向步骤(I)所得的聚甲基丙烯酸甲酯微粒中，缓慢加入含Img罗丹明的750 μ I二氯甲烧，加入时间可以超过5min，继续搅拌5min。通过注射栗以0.5ml/min速度加入水25ml，然后空气气流去除一些溶剂定容到30ml。对微粒进行离心去除上清液，用90%乙醇清洗三遍，清洗后的微粒用30ml水悬浮，即得纳米荧光微粒。
[0023]实施例2纳米荧光微粒的表征
取实施例1制备的10 μ I纳米荧光微粒，悬浮在750 μ I水中进行检测，在610nm处收集微粒的激光光谱，发射光谱在580nm处采集。对微粒进行扫描电镜测试，粒径在270~290nm之间，粒径均匀，具体如图1、图2所示。
[0024]实施例3纳米荧光微粒适用于核酸扩增试剂盒的荧光探针的制备
检测探针由两条长短不同但是具有互补序列的探针构成。荧光探针:荧光探针与靶序列负链互补，由28个核苷酸组成，其5’端和荧光离子结合，其3’端带一延伸阻断分子磷酸。淬灭探针:淬灭探针和荧光探针5’端互补，其3’端连接一个淬灭分子对甲基红。合成原料为四种碱基、甲基红CPG、磷酸CPG、均购自美国SIGMA公司，荧光粒子为自制。探针采用PE公司产391A型DNA合成仪自动合成。探针的修饰在合成过程中自动生成。合成完毕浓氨水55°C切割并脱保护15小时后经Micro Pure II反相纯化柱纯化，探针进一步用高效薄层色谱板纯化，最后用分光光度计定量。
[0025]实施例4 PCR检测步骤混合50μ1反应体系，内含引物15pmol，各探针15pmol，检测不同浓度的DNA50_100ng，
I X PCR缓和液，Taq DNA聚合酶2μ1，Mg++终浓度3pmol/L，然后在天隆PCR仪器上，96° C下预变性2min，然后94°C变性1sec, 53°C复性30sec, 60°C延伸40sec,共40循环。16个样本(四个梯度，其中一个为10个样本量)，在四种波长下检测，如图3~6所示。
[0026]由图3~6可知:同一种样本在不同激发波长下，测定的CT值差值为0.3内，荧光集团稳定，扩增效率高，斜率为-3.31。
[0027]另外，使用市面上较为常见的某荧光纳米颗粒与本发明在FAM激发波长480nm做比较，由图7可知:本发明荧光纳米微粒荧光强度高于市面上的荧光强度，结果稳定可靠，易于推广。
[0028]上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1.一种纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩增检测中的应用，其特征在于:所述的纳米荧光微粒具有包括内核与外壳的核壳结构，粒径为270~290nm，其内核为包含有荧光分子的聚合物微粒，外壳具有修饰在所述聚合物微粒外表面上的一种或多种官能团，该所述官能团能够直接与配体或生物大分子反应形成微粒表面的共价键连接，或在激活后与配体或者生物大分子进行共价标记；所述的聚合物微粒为聚甲基丙烯酸甲酯的微粒或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微粒或者它们的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯单元的重量至少占所述纳米荧光微粒总重量的50%，所述的荧光分子的重量占所占纳米荧光微粒总重量的0.05°/『5%，所述的纳米荧光微粒与分子探针结合构成荧光探针，用于单联或多联核酸扩增检测。2.根据权利要求1所述的纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩增检测中的应用，其特征在于，所述的纳米荧光微粒还包含一种或者一种以上的通过所述官能团共价连接而覆盖在所述纳米荧光微粒表面的生物活性物种，该所述的生物活性物种选自抗体、抗原、核酸、配体、受体、人工多肽、蛋白质以及多糖中的一种，所述的生物活性物种能够参与特异性识别和结合反应。3.根据权利要求1所述的纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩增检测中的应用，其特征在于，所述的纳米荧光微粒是通过以下步骤制得的: 1)、以所述的聚合物微粒和含有所述官能团的烯烃单体为原料，通过微乳液聚合法制备得到外表面上具有所述官能团的聚合物微粒； 2)、向步骤I)所得的外表面上具有所述官能团的聚合物微粒中缓慢注入含有所述荧光分子的有机溶剂和水，聚合物微粒发生溶胀，荧光分子进入聚合物微粒内，然后离心，除去上清液，清洗，加水悬浮，即得所述纳米荧光微粒，其中所述有机溶剂为丙酮或二氯甲烷。4.根据权利要求1所述的纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩增检测中的应用，其特征在于，所述的官能团为羧基。5.根据权利要求4所述的纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩增检测中的应用，其特征在于，所述的其他单体为甲基丙烯酸。6.一种单联或者多联核酸扩增检测试剂盒，包括荧光探针，其特征在于:所述荧光探针由权利要求1至5中任一项权利要求中所述的纳米荧光微粒与分子探针结合而成。
【专利摘要】<b>本发明公开了</b><b>一种纳米荧光微粒在单联或者多联核酸扩增检测中的应用，采用纳米荧光微粒结合分子探针作为荧光探针用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒，该纳米荧光微粒具有包括内核与外核的核壳结构，粒径为</b><b>270~290nm</b><b>，其内核为包含有不同梯度的荧光分</b><b>子的聚合物微粒，外壳具有修饰在所述聚合物微粒外表面上的一种或多种官能团。本发明的纳米荧光微粒粒径稳定、光谱适用于可见发射光，该纳米荧光微粒通过不同的荧光表达，可用于制备实时荧光定量PCR检测中所需的荧光探针，适用于单一核酸扩增（PCR-荧光探针）检测试剂盒也适用于三联核酸扩增（PCR-荧光探针）检测试剂盒，该荧光探针使用寿命长、检测灵敏度高、检测结果稳定可靠。</b>
【IPC分类】C09K11/06, C09K11/02, C12Q1/68
【公开号】CN105063225
【申请号】CN201510561074
【发明人】李超
【申请人】苏州纳诺康生物技术有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月7日