番石榴炭疽病菌特异性pcr检测引物及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及番石榴炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，专用于番石榴炭疽病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间番石榴炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
【背景技术】
[0002]由胶孢炭疽菌(Colletotrichim侵染引起的番石植炭疽病是世界热带和亚热带地区番石榴采前和采后的重要病害，在世界各地，每年番石榴因此病损失达到5%?15%。番石榴通常在成熟早期感染此病，但病原菌保持体眠，一直到果实成熟后才有病害症状的发展，成熟果实上最初的症状是产生暗褐色、圆形凹陷的病斑，这些病斑通常合并在一起产生大的腐烂区域。在田间，炭疽病使未成熟和成熟的果实腐烂，但成熟果实表现得更严重，在采收期间和采后造成的形态上和生理上的受损点通常被“创口病原菌”侵入，这一系列病原菌导致最具毁灭性的采后病害，番石榴炭疽病菌就是其中之一，因此，快速、准确地在发病前或初期以及收获时对病菌的侵染动态进行监测，及时采取有效的防治方法对控制病害在田间和储运中的发生，减少经济损失具有十分重要的意义。
[0003]传统炭疽病菌的分类与鉴定主要基于形态学特征及致病性测定等，这种鉴定方法耗时较长、程序繁琐、灵敏度低以及经验性强，从发病植株中分离并鉴定病原菌需要数天时间，难以做到对病害发生及时监测和有效控制病原菌的传播与病害流行。同时，传统的检测方法在果实储藏和运输之前不能明确炭疽病菌潜伏侵染的状况，造成已被炭疽病菌侵染的番石榴果实在储运过程中大量腐烂，产生巨大损失。随着分子生物学技术的发展，利用真菌核糖体转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行聚合酶反应(polymerase chain react1n, PCR)扩增，从而达到对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用。国内外已有研究人员利用核糖体转录间隔区(ITS)基因为病原菌检测靶标，开发出了灰霉菌、疫霉菌、枯萎病菌、链格孢等不同病原真菌的特异性检测引物，并利用特异性引物进行PCR扩增，达到病原菌快速、准确的检测和鉴定。目前，尚未见有关番石植炭疽病菌(CoWe?οiricA?
分子检测的报道。本发明通过对炭疽菌属(CoWe1iricAiM?)的ITS序列进行比对分析，设计出I对可用于特异性检测番石榴炭疽病菌的引物，为番石榴炭疽病菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地采取防治措施。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术中对番石榴炭疽病菌检测和鉴定，主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行以及采后病害造成腐烂变质的问题，提供了一种番石榴炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR检测引物和检测方法检测番石榴炭疽病菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。
[0005]实现本发明的目的包括下列步骤(技术方案):
1.通过测定番石植炭疽病菌(Colle to trichum glosopor1ides)和其它炭疽病菌(Colle to trichum spp)的核糖体转录间隔区(ITS)基因，对炭疽菌属不同种间ITS基因序列进行比对分析，设计出对番石榴炭疽病菌具有特异性扩增作用的I对引物，即特异PCR检测引物的序列为:
上游引物 CGF:5’ - CGGGTAGGGTCTCCGTGA -3’，
下游引物 CGR: 5’- CCCAGTGCGAGACGTAAAGT -3’ ；
对番石榴炭疽病菌特异性扩增出390 bp的产物。
[0006]2.番石榴炭疽病菌特异分子检测方法的建立
(I)感染番石榴炭疽病菌的果实组织DNA的提取.用于检测果实中番石榴炭疽病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下:向
1.0mg发病果实组织中加入0.5 mo I/L NaOH 10 μ?，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12，000 rpm 离心 6 min，取上清液 5 μ? 加入 0.1 mol/L Tris-HCl (pH=8.0)495|J-L混合均匀，取1.0 PL作为PCR模板进行扩增。
[0007](2 )以步骤(I)提取的DNA为模板，利用CGF/CGR这一对弓丨物进行PCR扩增。PCR反应体系 25 41^，包括2.5 μ? 10XPCR buffer(Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/LdNTP，1.0 U 7?必NA聚合酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，引物CGF/CGR各0.4 Mmol/L，25 ng DNA模板，不足部分用无菌超纯水补足；扩增参数为:95 °C预变性5 min, 94 °(:变性30 S，61 °C退火45 S，72 °C延伸30 S，共35个循环，最后72 °C延伸10 min。
[0008](3)取步骤(2)的PCR扩增产物5.0 μ?用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，70-100V，40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约390bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在番石榴炭疽病菌，否则所述的检测样品中未存在番石榴炭疽病菌。
[0009]本发明的关键性技术是番石植炭痕病菌尚效特异性PCR检测引物的设计及其检测方法的建立。为了获得番石榴炭疽病菌的特异PCR检测引物序列，以来源于我国福建、海南和广东等不同省份的18株番石榴炭疽病菌和多个炭疽属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下:取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中(菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜)，加入900 μ? 2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2% CTAB ；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0 ；20 mmol/L EDTA，pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和90 μ? SDS (十二烷基苯磺酸钠)【注:CTAB，SDS需60°C预热】，使用振荡器振荡混匀，60°C水浴Ih (DNA释放至缓冲液中)，12000 r.min 1离心15 min ;取上清液700 μ?,加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液(三者体积比25:24:1)，轻轻振荡混匀，12000 r.min 1离心9 min ;取上清液500 KL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r.min 1离心5 min ;取上清液350 μ?，加入1/10体积3 mol.L 1 NaAc和2倍体积无水乙醇，_20°C沉淀30 min, 12000r.min 1离心5 min ;弃去上清液，加入700μ?冰70%乙醇进行洗涤(离心；倾掉上清液)，在超净工作台上瞭干无酒精味，加入30~60 )J-L TE( 10 mmol/T, Tris-HCl,0.1 mmol/L EDTA,pH8.0)溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至25 ng/^L待用。以真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITSl:5’-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3’和ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’ 对供试番石榴炭疽病菌(C Woso/wr1ii/es)的 ITS基因进行扩增，PCR 反应体系 50 μ?，包括 2.5 μι 10XPCR buffer (Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP，1.0 U 7?必NA聚合酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，引物TISl /几34各0.4 Mmol/L, 25 ng DNA模板，不足部分用无菌超纯水补足。扩增反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性I min、55°C退火30 S、72°C延伸I min，35个循环，最后72°C延伸10 min。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测序得到的番石植炭疽病菌(C.glosopor1ides、^] ITS 序列与 GenBank 中 Co I letotri chum属 18 个不同种的ITS基因序