列进行同源性比较分析，根据番石榴炭疽病菌与其它种间的差异位点(在B1Edit中比对)，用Primer Primer5软件设计了番石植炭疽病菌C.glosopor1ides热特异性引物，引物序列为:上游引物CGF:5’ - CGGGTAGGGTCTCCGTGA-3’，下游引物CGR:5’ -CCCAGTGCGAGACGT AAAGT-3’，引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。在已设计特异引物的基础上，通过PCR反应体系和扩增参数的优化，建立的番石榴炭疽病菌检测方法，以供试的番石榴炭疽病菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，对番石榴炭疽病菌特异性引物CGF/CGR的特异性进行验证，结果表明，引物CGF/CGR只能特异性地从供试的18个番石榴炭疽病菌DNA中扩增出大小约为390bp的条带，而其它炭疽菌、病原真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将番石榴炭疽病菌与其它炭疽菌和病原真菌区分开来，具有种的特异性，可用于番石榴炭疽病菌快速可靠的检测和鉴定。
[0010]本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果:
1.特异性强、准确性高:本发明是根据真菌核糖体转录间隔区(internal transcribedspacer, ITS)序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计了对番石榴炭疽病菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的番石榴炭疽病菌和携带番石榴炭疽病菌的果实组织进行了测试验证，只有番石榴炭疽病菌和携带该病菌的果实中能特异性地扩增出一条390 bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。
[0011]2.灵敏度高:传统的病原菌检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种传统方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而本发明将设计的特异引物与ITS基因通用引物(ITS1/ITS4)联合起来进行巢式PCR扩增后，对番石榴炭疽病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到I fg，比常规PCR检测高10000倍；
3.实用性好:番石榴炭疽病菌的快速检测，具有重要的实际应用价值。传统的番石榴炭疽病菌的检测方法一般是在植物出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，所需时间较长，给快速而精确地检测病原物增加了难度，传统的方法由于不能在病害发病前期及时进行田间的病原菌动态的监测和检测，时常给农业生产的防治延误时机。本发明可对植物组织中是否带番石榴炭疽病菌进行检测，如果能特异性地扩增出390bp的电泳条带，说明植物组织中存在番石榴炭疽病菌，因此本发明可用于番石榴炭疽病菌引起病害显症之前的早期监测，为确定病害防治最佳时期和制定防治策略的制定提供科学依据，因此本发明具有较好的实用性；
4.操作简便、快速:应用本发明方法，对带番石榴炭疽病菌的植物组织进行DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，整个检测过程采用DNA快速提取方法，操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短了检测时间，一般整个检测过程可在6小时内完成。
【附图说明】
[0012]图1为本发明所要检测的番石榴炭疽病菌的特异PCR扩增图，图中:泳道1、13为2000 bp Marker，泳道2为阳性对照，泳道3-6为番石榴炭疽病菌，泳道7为香蕉炭疽病菌，泳道8为西瓜炭疽病菌，泳道9为大豆炭疽病菌，泳道10为番石榴黑斑病菌，泳道11为恶疫霉菌，泳道12为阴性对照。
[0013]图2为本发明番石榴炭疽病菌的灵敏性检测扩增结果图，图2-a为单重PCR对番石榴炭疽病菌的灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR对番石榴炭疽病菌的灵敏性检测结果，图中泳道I为2000 bp Marker，泳道2为10 ng,泳道3为I ng，泳道4为100 pg，泳道5为10 pg，泳道6为I pg，泳道7为100 fg，泳道8为10 fg，泳道9为I fg，泳道10为100ag，泳道11为阴性对照，泳道12为阳性对照。
[0014]图3为本发明发病组织的检测结果图，图中泳道1、13为2000bp Marker，泳道2_3、5-6为自然发病的番石榴果实，泳道8-9为人工接种发病的番石榴果实，泳道4、7、10、12为阴性对照，泳道11为阳性对照。
【具体实施方式】
[0015]以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。
[0016]实施例1:PCR检测引物序列的设计及引物对番石榴炭疽病菌的特异性扩增
1.引物的设计与合成
将本实验室测序得到的1株番石植炭疽病菌(C glosopor1ides)的ITS序列与GenBank中Colle to trichumM 18个不同种的ITS基因序列进行同源性比较分析，根据番石植炭疽病菌与其它种间的差异位点(在B1Edit中比对)，用Primer Primer5软件设计了番石植炭疽病菌C.的特异性引物，引物序列为:上游引物CGF:5’ -
CGGGTAGGGTCT CCGTGA _3’，下游引物 CGR:5’- CCCAGTGCGAGACGTAAAGT _3’，引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。
[0017]供试菌株基因组DNA的提取
采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下:取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中(菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜)，加入900 μ? 2%CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2% CTAB ；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0 ；20 mmol/L EDTA，pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和90 μ? SDS (十二烷基苯磺酸钠)【注:CTAB，SDS需60°C预热】，使用振荡器振荡混匀，60°C水浴lh(DNA释放至缓冲液中)，12000 r.min 1离心15 min ;取上清液700 KL，加等体积酸、氯仿、异戊醇混合液(各体积比25:24:1)，轻轻振荡混勾，12000 r.min 1离心9 min ;取上清液500 KL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r.min1离心5 min ;取上清液350 μ?，加入1/10体积3 mol.L 1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20°C沉淀30 min, 12000 r.min 1离心5min ;弃去上清液，加入700μ?冰70%乙醇进行洗涤(离心；倾掉上清液)，在超净工作台上晾干无酒精味，加入 30~60 μ? TE (10 mmol/LTris-HCl,0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0)溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至25 ng/^L待用。
[0018]引物特异性PCR验证以供试的番石榴炭疽病菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，对番石榴炭疽病菌特异性引物(上游引物CGF:5’ - CGGGTAGGGTCTCCGTGA _3’，下游引物CGR:5’ -CCCAGTGCGAGACGTAAAGT _3’)的特异性进行验证。PCR反应体系 25 μ?，包括 2.5 μ? 1XPCRbuffer (Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U T^^DNA 聚合酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，引物CGF/CGR各0.4 Mmol/L, 25 ng DNA模板，不足部分用无菌超纯水补足。扩增反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性I min、61°C退火45S、72°C延伸30 s，35个循环，最后72°C延伸10 min。取5 μ? PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据DNA条带的有无及大小对番石榴炭疽病菌特异性引物的特异性进行验证。
[0019]引物特异性验证结果
PCR扩增结果表明，引物CGF/CGR只能特异性地从供试的18个番石榴炭疽病菌DNA中扩增出大小约为390bp的条带(图1)，而其它炭疽菌、病原真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物均可以将番石榴炭疽病菌与其它炭疽菌和病原真菌区分开来，具有种的特异性，可用于番石榴炭疽病菌快速可靠的检测和鉴定。
[0020]实施例2:引物对番石榴炭疽病菌基因组DNA的灵敏度检测
1.常规PCR扩增
用无