一种外泌体miRNA的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于小分子RNA高通量检测技术领域，具体涉及一种外泌体miRNA的定量 检测方法。
【背景技术】
[0002] 外泌体（Exosome)是一种晚期核内体（也称为多囊泡体）与胞膜融合后分泌到细 胞外的膜性小囊泡，电镜下其外观是一种特征性的"碟形"小体，直径在40-100nm之间，由 活细胞分泌而来，几乎所有类型的细胞都能分泌，其携带的核酸、蛋白质、脂质成分具有其 来源细胞的特异性，参与调控许多重要的细胞生理活动，如免疫应答、凋亡、血管生成、炎症 反应、凝结等过程，因此其在相关疾病包括神经退行性疾病、心血管疾病以及癌症等中具有 重要的研究意义，可成为多种疾病的早期诊断标记物，此外Exosome具有细胞间转移的功 能，也可作为生物载体用于基因治疗。
[0003] 目前肿瘤源性的exosomes内的microRNA在癌症早期诊断中是一个有较大潜力的 研究领域。一些类型的肿瘤异常表达某些microRNA(miRNA)，这些miRNA与肿瘤的发生、发 展的关系已有一些文献报道；此外基于微创（抽血）或无创（使用尿液或唾液等）的诊断方 法可以减少患者的痛苦和不便，也降低了分析成本，有利于临床肿瘤早筛检测的实践推广。
[0004] 目前针对exosomes内的miRNA在肿瘤早期诊断中的研究仅有为数较少的报道，而 且绝大多数研究是基于exosomes的miRNA的总浓度、定量PCR (Q-PCR)以及microRNA芯片 技术，其更多关注miRNA的表达和定量，仅局限于检测已知的miRNA表达谱。此外miRNA高 通量测序也正进行着相关尝试中，尽管其高通量以及探索新的microRNA标志物在肿瘤早 期诊断发展中起到了巨大的推动作用，但是传统的文库构建存在系统性的偏好性以及较高 的错误率，从而影响了检测的灵敏度，准确性以及相关应用。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种外泌体miRNA的定量检测方法以克服现有技术的不足。
[0006] 本发明提供的一种外泌体miRNA的定量检测方法，包括以下步骤：
[0007] ⑴外泌体总RNA的提取；
[0008] (2) 3'端和5'端特异性唯一标签接头连接；
[0009](3)反转录合成cDNA并进行PCR扩增；
[0010] (4)miRNA文库的筛选纯化与上机测序；
[0011] (5)纠错算法的信息分析。
[0012] 本发明的外泌体来自人外周血或体液，进行外泌体分离后，采用RNA提取试剂盒 进行外泌体总RNA的提取。
[0013] 本发明的外泌体miRNA的定量检测方法中，步骤（2)所述的特异性唯一标签接头 连接是指在常规miRNA接头的基础上添加了 8个随机的碱基N以及3个固定碱基CGA。接 头合成时随机碱基，由AUCG随机合成，因此可以提供4s种标签，即理论上每个原始miRNA片 段将被一组唯一的标签唯一标签识别，从而后续经过一系列PCR扩增后，不仅可以基于同 一个DNA模板的所有测序序列（duplication，DUP)簇矫正测序错误实现变异的精确检测， 同时基于每个标记的片段，将不再受PCR扩增的偏好性影响，实现精准定量。
[0014] 本发明方法的步骤（2)在RNA的3'端连接特异性唯一标签接头的序列为：CGANN NNNNNNAGAUCGGAAGAGACACGUCUGAACUCCAGUCAC;在5 '端连接特异性唯一标签接头的序列为： UACACUCUUUCCCUACACGACNNNNNNNNCGA。
[0015] 进一步地，在步骤（2)特异性唯一标签接头连接完成后，可以利用RNA浓缩液去除 溶液中的连接缓冲液、多余的盐离子及其他杂质，得到与5'端和3'端连接唯一标签接头的 RNA〇
[0016] 本发明方法中，步骤（3)是将5'端和3'端连接唯一标签接头的RNA反 转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，加入测序引物进行PCR;反转录引物序列为 GTGACTGGAGTTCAGACGTGT 〇
[0017] 进一步地，PCR所用的测序引物序列为：
[0018] 上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCC
[0019] TACACGACGCTCTTCCGATCT；
[0020] 下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACT
[0021] GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；
[0022] 其中 xxxxxxxx 为 index 标签。
[0023] 本发明的外泌体miRNA定量检测方法中，步骤（4)miRNA文库的筛选的方法是将步 骤（3)中的PCR产物中片段大小为150-170bp的cDNA片段回收，即得到主要成分为miRNA 的文库。
[0024] 在本发明的实施例中，是选用Illumina HiSeq2500/2000上机测序，PE101+8+101。
[0025] 本发明上述方法中，步骤（5)纠错算法的信息分析包括以下步骤：
[0026] 1)基于固定喊基CGA确定唯一标签位置，将成对测序序列的测序序列一和测序序 列二的唯一标签碱基序列首尾相连，形成16bp的一条索引，并且以这16bp作为成对测序序 列的索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；
[0027] 2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的汉 明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列 的汉明距离不超过3,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
[0028] 3)对于每个DNA模板的dup簇中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若 某种碱基型在测序序列中的一致率达到80%，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否 则记为N，得到代表原始DNA模板序列的新测序序列；
[0029] 4)基于新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序 列；
[0030] 5)根据4)中得到的测序序列进行数据库比对确定已知RNA以及进行未知RNA的 软件预测，同时也进行相应的注释与统计定量；
[0031] 6)根据5)的结果进行表达谱差异、革巴基因预测、Passway以及Biomarker其他相 关分析。
[0032] 本发明还提供了一种miRNA定量检测系统，包括以下操作单元：
[0033] (1)总RNA的提取单元；
[0034] (2) 3'端和5'端特异性唯一标签接头连接单元；
[0035] (3)反转录合成cDNA并进行PCR扩增单元；
[0036] (4)miRNA文库的筛选纯化与上机测序单元；
[0037] (5)纠错算法的信息分析单元。
[0038] 操作单元（1)中的总RNA为外泌体总RNA。
[0039] 所述单元⑵在RNA的3'端连接特异性唯一标签接头的序列为：CGANNNNNNNNAG AUCGGAAGAGACACGUCUGAACUCCAGUCAC;在5'端连接特异性唯一标签接头的序列为：UACACUC UUUCCCUACACGACNNNNNNNNCGA 〇
[0040] 单元（3)中是将5'端和3'端连接唯一标签接头的RNA反转录合成cDNA，然后以 cDNA为模板，加入测序引物进行PCR;反转录引物序列为GTGACTGGAGTTCAGACGTGT ;PCR所 用的测序引物序列为：
[0041]上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ;
[0042] 下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCT；
[0043]其中xxxxxxxx为index标签。
[0044] 单元（4)miRNA文库的筛选的方法是将单元（3)中的PCR产物中片段大小为160bp 的cDNA片段回收，即得到主要成分为miRNA的文库。
[0045] 本发明的miRNA定量检测系统中，操作单元（5)纠错算法的信息分析包括以下步 骤：
[0046] 1)基于固定喊基CGA确定唯一标签位置，将成对测序序列的测序序列一和测序序 列二的唯一标签碱基序列首尾相连，形成16bp的一条索引，并且以这16bp作为成对测序序 列的索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；
[0047] 2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的汉 明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列 的汉明距离不超过3,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
[0048] 3)对于每个DNA模板的dup簇（即同一个DNA模板的所有测序序列）中的测序 序列的每一个测序碱基进行互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到8