Ifitm3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用
【技术领域】
[0002] 本发明涉及蛋白质工程技术领域，更具体地，涉及IFITM3蛋白装载的外泌体在制 备抗登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC)感染药物中的应用。
【背景技术】
[0003] 登革病毒（dengue virus, DENV)属于黄病毒科黄病毒属中的一个病毒种，根据 抗原表位的不同分为1，2,3,4四种血清型（DENV1~4)。登革病毒主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti)和白纹伊蚊（Aedes albopictus)等昆虫媒介传播，引起登革热（dengue fever, DF)，以及病死率较高的登革出血热（dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合征 (dengue shock syndrome, DSS)。目前，登革热被列为全球最重要的蚊虫传播性疾病，已成 为一个严重的全球性公共卫生问题。尽管如此，目前国内外尚无有效的预防性疫苗，也无针 对病毒的特效性治疗药物。
[0004] 干扰素（interferon, IFN)，是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊 膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的。IFN是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制 病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制，同时 还可增强自然杀伤细胞（NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用， 并增强抗病毒能力。是目前最主要的抗病毒感染的生物制品。2008年，研究人员发现一株 2 型登革病毒株 DENV2 New Guinea C (NGC) (GenBank accession number M29095)可以 抑制宿主细胞的干扰素免疫应答，并最终确定这种抑制效应是毒株特异性而非血清型特异 性。该株登革病毒拮抗干扰素的机制目前正研究中：（1)其中很重要的一个方面是，登革病 毒具有拮抗IFN-I产生的能力。据报道，登革病毒NS2B/3蛋白酶通过靶向人细胞的MITA/ STING蛋白，干扰RIG-I和MDA5的信号传递，抑制宿主细胞IFN-I的产生。（2)另外研究发 现，登革病毒NS5与STAT2相结合，NS5蛋白通过蛋白酶体介导STAT2的降解而抑制IFN-I 下游信号途径。目前国内外尚未有针对干扰素拮抗病毒株感染的特异性有效治疗药物。
[0005] 1984年，Friedman等人在经IFN处理的神经细胞瘤细胞进行cDNA筛查时首次发 现干扰素诱导跨膜蛋白家方矣（interferon-inducible transmembrane proteins, IFITM)， 位于11号染色体上。人类该基因具有ifitml、ifitm2、ifitm3、ifitm5四种类型，表达的 蛋白为14-17 kD的跨膜蛋白。2009年Brass等]研究者基于大规模RNA干扰技术的基因 组功能筛查，发现IFITM家族蛋白作为一种干扰素诱导的抗病毒蛋白，能较强的抑制流感 病毒和黄病毒的对宿主细胞穿入过程，进而发挥高效的抗流感病毒活性。接着，相继揭示了 IFITM蛋白具有广谱的抗病毒活性。但是，IFITM蛋白在宿主细胞中参与抑制病毒穿入的 具体分子机制，以及该蛋白参与宿主的抗病毒天然免疫的作用方式尚未明确还有待深入研 究。
[0006] 外泌体（exosome)又称胞外体，是由细胞内的多泡体（multivesicularbody, MVB) 与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种膜性囊泡，大小为40~100 nm大小。目前研 究发现在病毒感染时，宿主细胞会将干扰素诱导的抗病毒蛋白包装成外泌体形式，进行抗 病毒蛋白的细胞间传递，使宿主形成更强的抗病毒免疫状态。2013年，袁正宏教授的研究团 队发现包装了抗病毒分子的外泌体可直接在肝细胞间传递，进而增强了 IFN-a诱导的抗 病毒免疫应答。外泌体传递宿主细胞抗病毒蛋白，为新型抗病毒药物的开发开拓了新的方 向。本研究通过探索包装抗病毒蛋白的外泌体，是否可以特异性地作用于干扰素拮抗的登 革病毒株（DENV-2 NGC)，如此可对未来的病毒性病原体所致的疾病的防治提供新的线索与 思路。
【发明内容】
[0007] 本发明人通过研究发现，通过本发明提供的IFITM3蛋白装载的外泌体能够特异 性抗登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC)，其作用机制为高表达IFITM3蛋白的外泌体能 够特异性地抑制登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC)穿过宿主细胞膜进入宿主细胞的过 程。这就为新型抗干扰素拮抗株病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方 向。
[0008] 本发明的目的通过以下技术方案实现： 1.构建高表达IFITM3重组质粒，制备方法为： 1) 根据IFITM3的基因序列，设计正向引物，如SEQ ID N0 :1所示，设计反向引物，如SEQ ID N0 :2 所示； 2) 根据PCR扩增产物，反应条件如下：94 °C预变性5 min;94 °C变性30 s，55 °C 30 s，72 °C 60 s，30个循环；72 °C延伸7 min，然后将所有扩增产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳 并切胶回收纯化； 3) 利用QIAprep spin miniprep kit抽提质粒，将pMSCV质粒DNA与IFITM3基因片段 PCR产物进行双酶切反应和连接，测序比对后，利用氯化铯梯度离心法提取pMSCV- IFITM3 重组质粒DNA。
[0009] 2. IFITM3蛋白装载的外泌体的制备方法： 1)构建IFITM3稳定高表达的293T细胞株。
[0010] 2)收集高表达IFITM3的293T细胞培养基上清。
[0011] 3)将上清采用蔗糖密度梯度超速离心法即得所述外泌体。
[0012] 3. IFITM3蛋白装载的外泌体的产量的鉴定方法： 应用Western Blotting检测蔗糖密度梯度超速离心法得到的外泌体中IFITM3的蛋白 水平。
[0013] 4. IFITM3蛋白装载的外泌体将IFITM3蛋白传递给受体细胞的鉴定方法： 1)采用IFITM3蛋白装载的外泌体处理HeLa细胞不同时间点后。
[0014] 2)应用WesternBlotting检测HeLa细胞中IFITM3的蛋白水平。
[0015] 5. IFITM3蛋白装载的外泌体的活性鉴定方法： 1)采用IFITM3蛋白装载的外泌体处理HeLa细胞。
[0016] 2) 24h后感染DENV-2 NGC，感染48h后提取细胞及上清的RNA。
[0017] 3)应用实时荧光定量RT-PCR检测细胞内及上清中病毒的RNA的拷贝数。
[0018] 6.外泌体将抗病毒蛋白IFITM3传递给受体细胞后，受体细胞是否能获得抗病毒 能力，鉴定方法： 1)采用IFITM3蛋白装载的外泌体处理HeLa细胞。
[0019] 2)24h后感染DENV-2 NGC，感染48h固定细胞。
[0020] 3)应用免疫荧光的方法检测经过包装有IFITM3的外泌体处理的HeLa细胞的病毒 感染情况。
[0021] 7. IFITM3蛋白装载的外泌体是否会刺激受体细胞产生干扰素，鉴定方法： 1)采用IFITM3蛋白装载的外泌体处理HeLa细胞。
[0022] 2) 24h后应用ELISA检测受体细胞HeLa的培养上清中的IFN- a和IFN- 的蛋 白水平。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明所提供的IFITM3蛋白装载的外泌体可以传递宿主细胞抗病毒蛋白，并特异性 的抑制登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC)。这就为新型抗干扰素拮抗株病毒药物的开发 和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方向。
【附图说明】
[0024] 图1是高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome中IFITM3 蛋白表达的Western Blotting鉴定结果图。
[0025] 图2是用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理 HeLa细胞后，HeLa细胞中IFITM3蛋白表达变化的电泳图。
[0026] 图3是用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理 对照组的HeLa细胞以及沉默了内源性IFITM3的HeLa细胞不同的时间点后，HeLa细胞中 IFITM3蛋白表达变化的时间效应的电泳图。
[0027] 图4是实时荧光定量RT-PCR方法检测用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培 养上清中提取的exosome处理HeLa细胞后，HeLa细胞内感染的DENV-2 NGC RNA结果图。
[0028] 图5是Real time RT-PCR方法检测用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养 上清中提取的exosome处理HeLa细胞后，HeLa细胞培养基上清中的DENV-2 NGC RNA结果 图 图6是免疫荧光方法检测用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的 exosome处理HeLa细胞后，HeLa细胞病毒感染情况的结果图 图7是用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理HeLa 细胞，培养上清中IFN-a蛋白含量的ELISA结果图。
[0029] 图8是用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理 HeLa细胞，培养上清中IFN-P蛋白含量的ELISA结果图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合一些【具体实施方式】对本发明做进一步解释和说明。具体实施例为进一步 详细说明本发明，非限定本发明的保护范围。
[0031] 实施例1 :pMSCV-IFITM重组质粒的构建、鉴定及提取 从GenBank数据库下载IFITM3基因序列，利用Primer Premier 5. 0软件自行设ir| 对引物扩增全长IFITM3基因，引物由上海英俊生物公司合成。引物序列为： Forward: 5'GGAAGATCTGCCATGAATCACACTGTCCAAACCTTC Reverse:5 'CCGGAATTCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCCATAGGCCTGGAAGATCAG 利用Trizol法提取细胞总RNA后，以核酸蛋白定量仪分别测定RNA浓度，根据所测得 的浓度，将全部RNA用无RNA酶的水稀释成终浓度为1yg/y1。我们利用提取到的细胞 RNA得到IFITM3基因的cDNA产物，再根据PCR扩增产物，反应条件如下：94 °C预变性5 min ;94 °C变性 30 s，55°C30 s，72 °C60 s，30 个循环；72 °C延伸 7 min。将所有扩 增产物用1. 5%琼脂糖凝胶(含终浓度为0. 5yg/ml的EB)电泳并切胶回收纯化。
[0032]利用 QIAprep spin miniprep kit 抽提质粒，将 pMSCV 质粒 DNA 与 IFITM3 基因片 段PCR产物进行双酶切反应和连接，在200 yl DH5a感受态细菌中加入10 yl连接产物 中，37 °C培养箱中，倒置平板培养12~16 h至长出菌落。最后挑取单菌落接种于3 ml 含氨苄青霉素（50 μg/ml)的LB培养液中，37°C 300 rpm摇菌过夜。
[0033] 经双酶切鉴定正确的阳性克隆菌送上海英俊公司测序，利用DNASTAR软件系统的 SeqMan模块程序对测序结果进行序列比对分析。确定无误后，利用氯化铯梯度离心法大量 提取PMSCV-IFITM3重组质粒DNA。
[0034] 实施例2:稳定高表达外源性IFITM细胞系的建立 1.磷酸钙法转染制备逆转录病毒：取对数期生长的293FT，将20 yg的