早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种职业病检测筛查试剂盒，特别是涉及一种早期矽肺患者血清外泌 小体miRNAs检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 尘肺病是我国主要的职业病之一，约占职业病总人数的80%。我国矽肺病例占总 病例50%，位居第一，是尘肺中危害最严重的一种。目前，矽肺的诊断标准主要依靠影像学， 往往在病人出现明显症状时才能诊断出患有矽肺，这时任何药物都无法逆转已发生的肺纤 维化病变。因此，寻找快速简便的矽肺早期生物标志物，开展二级预防显得十分必要。
[0003] 生物标志物的选择条件是快速、简便和稳定，人体外周血血清非常容易获取，血清 中外泌小体表达水平不随温度、酸碱性、时间而快速变化。外泌小体是由细胞内多泡体与细 胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30~120nm的膜性囊泡，这些膜性外泌 小体在细胞之间穿梭传递重要信息，也会进入血液、唾液、尿液及乳汁等体液中，产生远程 调控作用，实验证明，B细胞来源的外泌小体通过整合可与细胞外基质中的胶原-I和纤维 结合蛋白相结合，表明体内分泌的外泌小体经与细胞外基质相互连接，减少外泌小体的扩 散，增加局部浓度，从而提高了外泌小体在局部的生理作用。外泌小体内包含有大量的特定 miRNAs和特定蛋白质，带有大量的特定信息在细胞之间来回传递，因此认为选用血清中的 外泌小体miRNAs作为生物标志物是可行的。外泌小体的提取一般采取超速离心或化学提 取法，超速离心法存在提取费时（需48小时）费力和超离设备条件过高，并且由于过高的 转速对操作者的安全构成威胁。单纯化学试剂提取法存在得率偏低等缺陷。miRNAs是在 真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷 酸，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNAs，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶 mRNAs或者阻遏靶mRNAs的翻译。
[0004] 最近的研宄表明miRNAs参与到矽肺发生发展的各个过程，并且已经研宄发现了 一些特定的miRNAs调控砂肺纤维化的发病机制，比如miR-155、miR_29a。
[0005] 目前，qPCR技术已经成功应用于多种疾病的miRNAs检测，但尚未见该方法在矽肺 病人血清中的外泌小体miRNAs检测方面的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种早期矽肺患者血清外泌小体 miRNAs检测试剂盒。
[0007] 本发明的技术方案概述如下：
[0008] 早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒，包括：血清分装管，外泌小体 miRNAs提取试剂盒，外参线虫miR39试剂，逆转录试剂盒，hsa-U6引物，cel-miR-39引物， miRNAs引物试剂盒，qPCR检测试剂盒，无 RNA酶的EP管，无水乙醇和CldH2O，所述miRNAs引 物试剂盒包括SEQ ID NO. 1所示的miR-16-5p上游引物和SEQ ID NO. 2所示的let-7d-5p 上游引物。
[0009] 本发明的优点：
[0010] 1)本发明的方法可使血清外泌小体的HIiRNAs提取得率高。梯度离心结合化学试 剂提取法可以定量地从体液中提取外泌小体，减少了超高速离心法的危险性和化学法提取 得率偏低的风险，为获得外泌小体中的miRNAs带来便利；
[0011] 2)选用的miRNAs在外泌小体中均为高表达。miR-16_5p、let_7d_5p在血清外泌 小体中的表达相对较高，避免了极低表达量难以检测的缺陷。
[0012] 3)使用本发明的试剂盒鉴定疑似早期矽肺患者具有快速、高效、简便的特点。扩增 效率高，灵敏度、特异性高，整个检测反应只需6小时即可完成，操作安全。
[0013] 本发明的方法、体系可以快速高效地检测到矽肺病人血清中的外泌小体 microRNAs，为检测筛选疑似早期矽肺患者提供了新的技术平台，易于推广应用，具有较大 的经济、社会效益。
【附图说明】
[0014] 图1为早期矽肺患者血清外泌小体miR-16_5p的qPCR溶解曲线。
[0015] 图2为早期矽肺患者血清外泌小体miR-16_5p的qPCR扩增曲线。
[0016] 图3为早期矽肺患者血清外泌小体let-7d_5p的qPCR溶解曲线。
[0017] 图4为早期矽肺患者血清外泌小体let-7d_5p的qPCR扩增曲线。
[0018] 图5为早期矽肺患者血清外泌小体U6的qPCR扩增曲线。
[0019] 图6为早期矽肺患者血清外泌小体U6的qPCR溶解曲线。
[0020] 图7为早期矽肺患者血清外泌小体线虫miR39的qPCR扩增曲线。
[0021] 图8为早期矽肺患者血清外泌小体线虫miR39的qPCR溶解曲线。
[0022] 图9为早期矽肺患者血清外泌小体miR-155_5p的qPCR扩增曲线。
[0023] 图10为早期矽肺患者血清外泌小体miR-155_5p的qPCR溶解曲线。
[0024] 图11为早期砂肺患者血清外泌小体miRNAs诊断ROC曲线。
[0025] 图12 let7d_5p Δ CT值判定早期矽肺的概率。
[0026] 图13 miR16的ACT值判定早期矽肺的概率。
[0027] 图14 let7d_5p和miR16的Δ CT值判定早期矽肺的概率。
【具体实施方式】
[0028] 下述试剂均为商品，其厂商为：
[0029] I. 5ml血清分装管，购自购自美国Axygen公司；
[0030] 外泌小体 miRNAs 提取试剂盒，内含 ExoQuick、Lysis Buffer、Wash Buffer、 Elution Buffer、SeraMir RNA Columns，均购自美国 SBI (System Biosciences)公司；
[0031] 外参线虫miR39试剂，购自天根生化科技（北京）有限公司，货号CRlOO-Ol ;
[0032] 逆转录试剂盒，内含.TransScriptli miRNA RT Enzyme Mix、2XTS miRNA Reaction Mix,均购自北京全式金生物技术有限公司；
[0033] hsa_U6引物，购自天根生化科技（北京）有限公司，货号⑶201-0145 ;
[0034] cel-miR-39引物，购自天根生化科技（北京）有限公司，货号⑶200-01 ;
[0035] miRNAs引物试剂盒，内含miR-16-5p上游引物；、let-7d-5p上游引物；
[0036] qPCR检测试剂盒，内含Universal miRNA qPCR Primer (IOuM)、2><TransStartK Top Green
[0037] qPCRSuperMix、Passive Reference Dye (50 X) (Optional)，均购自北京全式金生 物技术有限公司；无 RNA酶的EP管，购自美国GEB (Gene Era Biotech)公司；
[0038] 无水乙醇，购自天津市江天化工技术有限公司；
[0039] ddH20,购自北京全式金生物技术有限公司。
[0040] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0041] 实施例1
[0042] 一种早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒，包括：
[0043] I. 5ml血清分装管；
[0044] 外泌小体miRNA提取试剂盒，内含ExoQuick、Lysis Buffer、Wash Buffer、Elution Buffei\
[0045] SeraMir RNA Columns ；
[0046] 外参线虫miR39试剂；
[0047] 逆转录试剂盒，内含TransScripl/ miRNA RT Enzyme Mix、2 X TS miRNA Reaction Mix ；
[0048] hsa_U6 引物；
[0049] cel-miR-39 引物；
[0050] miRNAs 引物试剂盒，内含 miR-16_5p、let-7d_5p ;
[0051] qPCR检测试剂盒，内含Universal miRNA qPCR Primer (IOuM)、2xTransStart^ fTop Green
[0052] qPCRSuperMix、Passive Reference Dye (50X) (Optional);
[0053] 无 RNA酶的EP管；
[0054] 无水乙醇；
[0055] (IdH2O0
[0056] 实施例2
[0057] 使用本发明的试剂盒检测早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs的方法：
[0058] 一.血清样品采集与处理
[0059] 疑似早期矽肺患者空腹8小时于清晨抽取静脉血5毫升，不抗凝；30分钟内放 入4°C冰箱保存；3小时内于4°C 3500rpm离心10分钟