Rbx1作为血清标志物的应用及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了RBX1作为血清标志物的应用，RBX1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，RBX1作为血清标志物可用于诊断和预示肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌等；本发明还公开了RBX1血清检测试剂盒，该试剂盒能够用于肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的移转复发监控等，具有特异性好、灵敏度高等优点，可早于体征发现，具有重要的临床意义。
【专利说明】RBX1作为血清标志物的应用及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于用于癌症的标志物，具体涉及RBXl作为血清标志物的应用，还涉及RBXl的血清检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]RBXl (Ring-boxl)蛋白，又称为ROCl蛋白，是泛素连接酶E3复合物一SCF复合物的组成成分，蛋白保守程度高。RBXl蛋白由Rbxl基因(NM_014248)编码，该基因定位于22号染色体22ql3.2区，cDNA全长为521bp，开放阅读框为327bp，编码108个氨基酸，预测蛋白的分子量大约为12kDa。RBXl也能与其他亚基相互作用形成复合物发挥泛素连接酶作用，如RBXl与eullin-Ι形成异源二聚体从而催化泛素化进程，在蛋白的泛素化过程中发挥了重要的作用。蛋白质是执行生命活动的基本分子，细胞中的蛋白质不断地处于合成、修饰与降解的代谢更新过程中。泛素介导的蛋白质降解参与到细胞周期、炎症反应、细胞凋亡、抗原提呈等许多生命过程中。因此，泛素介导的蛋白质降解途径的异常与许多疾病，如恶性肿瘤、肌肉萎缩等的发生密切相关。Jia等通过免疫组织化学方法检测RBXl在肺癌、肝癌、乳腺癌、肠癌、卵巢癌中过表达，且通过基因沉默可刺激细胞死亡、细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞生长，表明ROCl可作为抗肿瘤靶点(RBX1/R0C1-SCF E3ubiquitin Iigaseis required for mouseembryogenesis and cancer cell survival.Cell Division2009,
4:16 ；R0Cl/RBXlE3Ubiquitin Ligase Silencing Suppresses Tumor CellGrowth viaSequential Induction of G2—M Arrest, Apoptosis, and Senescence Lijun Jia, MariaS.Soengas，and Yi Sun.Cancer Res2009 ;69: (12).Junel5，2009)。Wei 等公开了 RBXl 在肿瘤细胞中过表达，抑制RBXl可使肿瘤细胞衰老、凋亡，同时抑制RBXl也影响正常组织细胞(Small RING Finger Proteins RBXland RBX2of SCF E3Ubiquitin Ligases:The Rolein Cancer and as Cancer Targets.Genes&Cancerl.(7)700 - 707.2010)。后续研究证实通过降低RBXl表达能够抑制肝癌细胞的生长和分化，并且ROCl表达水平与预后相关，可作为肝癌干预的靶点。在其他癌症中，诸如膀胱癌和非小细胞肺癌也与RBXl表达相关，可以作为治疗靶点和疾病诊断。
[0003]虽然目前已在不同的组织细胞中检测到RBX1，且与其肿瘤(如肝癌、乳腺癌、肠癌)相关，以及与癌细胞的生长和分化相关，但目前为止RBXl的可溶形式从未被提及，即RBXl在血清中的存在与癌细胞的相关未见报道。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供RBXl作为血清标志物的应用；本发明的目的之二在于提供RBXl血清检测试剂盒。
[0005]为实现上述发明目的，提供如下技术方案:
[0006]RBXl作为血清标志物的应用，所述RBXl的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]优选的，所述血清标志物为诊断和预示肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌的血清标志物。
[0008]优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0009]2.RBXl血清检测试剂盒，所述试剂盒含有捕获血清RBXl的捕获剂，所述RBXl的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]优选的，所述捕获剂为特异识别RBXl的抗体。
[0011]优选的，所述捕获剂为兔RBXl单克隆抗体。
[0012]优选的，所述捕获剂固定于固相载体上。
[0013]更优选的，所述固相载体为酶标板。
[0014]更优选的，所述试剂盒还含有酶标多克隆抗体和显色底物。
[0015]优选的，所述酶标多克隆抗体为HRP标记的鼠RBXl多克隆抗体，所述显色底物TMB。
[0016]本发明的有益效果在于:本发明公开了 RBXl作为血清标志物的应用，因此可以通过检测血清中的RBXl来诊断和预示肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌等疾病，检测血清具有取样方便，给患者带来的痛苦较少；本发明还公开了 RBXl血清检测试剂盒，该试剂盒能够用于肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的移转复发监控等，具有特异性好、灵敏度高等优点，可早于体征发现，具有重要的临床意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0018]图1为RBXl血清检测试剂盒检测肠癌患者与健康人血清中RBXl浓度散点图。
[0019]图2为RBXl血清检测试剂盒检测肠癌患者与健康人血清的ROC曲线。
[0020]图3为RBXl血清检测试剂盒检测肝癌患者与健康人血清中RBXl浓度散点图。
[0021]图4为RBXl血清检测试剂盒检测肝癌患者与健康人血清的ROC曲线。
[0022]图5为RBXl血清检测试剂盒检测乳腺癌患者与健康人血清中RBXl浓度散点图。
[0023]图6为RBXl血清检测试剂盒检测乳腺癌患者与健康人血清的ROC曲线。
[0024]图7为RBXl血清检测试剂盒检测胃癌患者与健康人血清中RBXl浓度散点图。
[0025]图8为RBXl血清检测试剂盒检测胃癌患者与健康人血清的ROC曲线。
[0026]图9为RBXl血清检测试剂盒检测胰腺癌患者与健康人血清的RBXl浓度散点图。
[0027]图10为RBXl血清检测试剂盒检测胰腺癌患者与健康人血清的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0028]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0029]实施例1建立RBXl血清检测反应体系
[0030]将浓度为5 μ g/mL兔RBXl单克隆抗体包被ELISA板，于4°C条件下包被过夜，洗板；然后每孔加入200 μ L酶标板稳定剂I (IBS-001)(购自湖州英创生物科技有限公司)，在37°C封闭I小时，洗板3次，将；将浓度度分别为0pg/mL，31.25pg/mL，62.5pg/mL, 125pg/mL, 250pg/mL, 500pg/mL, lOOOpg/mL的标准品(RBX1重组蛋白)或样品加入到封闭板中，在37°C条件下反应I小时，洗板三次；然后使用浓度为0.5 μ g/mL的HRP标记的鼠RBXl多克隆抗体(购自Novus Biologicals，货号为H00009978-B01 )，37°C条件下反应I小时后洗板三次，用TMB显色2-3分钟，再用浓度为2M硫酸终止反应，最后检测在450nm处的OD值。
[0031]检测体系优化:
[0032]RBXl抗体:购买三株RBXl抗体，鼠RBXl多克隆抗体(购自Novus Biologicals，货号为H00009978-B01);兔RBXl多克隆抗体(购自OriGene，货号为TA317744);兔RBXl单克隆抗体(购自abcam，货号为abl33565)，比对三种抗体对检测体系的影响。结果显示，RBXl抗体优选abeam提供的产品,其工作浓度为5 μ g/mL。
[0033]RBXl重组蛋白(SEQ ID N0.3):购买3株RBn重组蛋白，分别为NovusBiologicals公司提供、货号为H00009978-P01的RBXl重组蛋白；abcam公司提供、货号为abl57035的RBXl重组蛋白；0riGene公司提供、货号为TP300348的RBXl重组蛋白，比对3种重组蛋白对检测体系的影响。结果显示,Novus Biologicals公司提供的RBXl重组蛋白效果最佳，其最佳工作浓度为L6ng/mL。
[0034]酶标多克隆抗体使用HRP标记Novus Biologicals的鼠多克隆抗体(HRP标记试剂盒购自湖州英创生物科技有限公司，标记方法按试剂盒说明书进行)。使用该酶标多克隆抗体的最佳工作浓度为0.5 μ g/mL。在此条件下，可实现背景OD值< 0.1，有效区分阴性组与阳性组，且具有统计学意义。
[0035]固相载体的确定:对4种不同厂家的酶标板进行了比较,分别为美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc,结果表明，美国corning公司(货号为:9018)和thermo (货号为:468667)公司的酶标板符合背景OD值< 0.1，且信噪比较高。
[0036]包被液的选择:根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液(PH7.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.6)检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液(PH9.6)可满足空白组OD值< 0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
[0037]稀释剂的选择:稀释剂作为试剂盒组分之一，主要用于稀释标准品、酶标抗体，并稳定反应体系，由于稀释对象具有生物活性，市面已有商品化稀释剂，同时可查询到多种稀释剂配方，本实施例通过实验对比了 2种商品化稀释剂(分别购自天津博美科生物技术有限公司(货号BMKF017-1)和上海西唐生物科技有限公司(货号C0901))和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂效果更佳，自制稀释剂的终浓度如下:含浓度为3m的EDTA、质量分数为0.5%的BSA、I XPBS、质量分数为0.05%的Tween-20和质量分数为0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0038]稳定剂的选择:使用3种不同稳定剂(具体如下:稳定剂1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl ;稳定剂I1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油，质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl，稳定剂II1:体积分数为68.8%的PBS，体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞)分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用时按体积比为1:100稀释。并于第O天、第7天和第14天进行检测。结果显示稳定剂III效果最佳，具体组分为:体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%血清和质量分数为0.2%硫柳汞。
[0039]通过以上主要原材料的研究确定了检测体系的主要组分，建立了成熟的RBXl血清检测体系。
[0040]实施例2RBX1血清检测试剂盒
[0041]根据实施例1中建立RBXl血清检测体系构建RBXl血清检测试剂盒，具体组分如表1所示:
[0042]表1、RBXl血清检测试剂盒
[0043]
【权利要求】
1.RBXl作为血清标志物的应用，所述RBXl的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述血清标志物为诊断和预示肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌的血清标志物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
4.RBXl血清检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有捕获血清RBXl的捕获剂，所述RBXl的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:所述捕获剂为特异识别RBXl的抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述捕获剂为兔RBXl单克隆抗体。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述捕获剂固定于固相载体上。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述固相载体为酶标板。
9.根据权利要求4-8任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还含有酶标多克隆抗体和显色底物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于:所述酶标多克隆抗体为HRP标记的鼠RBXl多克隆抗体，所述显色底物TMB。
【文档编号】G01N33/68GK103675300SQ201410003092
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】王弢, 秦勇, 周小进, 渠香云 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司