专利名称：膀胱癌的血清miRNA生物标志物及其表达量检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术和肿瘤学领域，尤其是涉及膀胱癌的血清miRNA生物标志物的检测方法及表达量的检测方法。
背景技术：
膀胱癌是一个重要的公共问题，在世界范围内，膀胱癌的发病率居恶性肿瘤的第四位，是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。临床上，膀胱镜检查及尿脱落细胞学检测仍是当前诊断膀胱癌不可替代的金标准，但是膀胱镜检查会带给患者创伤和昂贵的检测费用，而细胞学检查的敏感性低。所以，膀胱癌的分子生物学研究日益受到国内外的重视，希望从分子水平上揭示膀胱癌的发生、发展、转移及转归，从而提高膀胱癌的诊治水平。近几年来，大量研究资料表明，多种微小RNA(microRNA，miRNA)参与了肿瘤细胞的生物调控过程，间接发挥着癌基因和抑癌基因的功能，在肿瘤的发生和发展中起了至关重要的作用。miRNAs是一类在生物体中广泛存在的进化上保守的内源性非编码小RNA，其长度约为21nt，能够与靶基因mRNA的3’ -UTR区特异性碱基配对，从而导致靶基因的降解或抑制其翻译，影响靶基因的产物生成，主要参与基因的转录后水平调控。目前，关于miRNA与膀胱癌的研究已经展开，并在不断深入。几个基于芯片技术和生物信息学的研究已发现一些与膀胱癌密切有关的miRNA。近几年的研究均显示，miRNA在组织和细胞中的表达表现为显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性。但是，由于肿瘤标本来源的限制，使得组织miRNA在临床上的应用存在一定局限性。而外周血标本的获得却十分简便，如果能在血液中检出癌症特异性的miRNA并将其作为癌症的生物学标志，对于早期诊断癌症具有至关重要的意义。进一步的研究发现miRNA在外周血中的表达同样具有肿瘤相关性和组织特异性，外周血miRNA可能成为理想的肿瘤标志物。miRNA在血液中可长期稳定存在，RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会造成血清miRNA的损失。正是血清miRNA良好的稳定性，为循环miRNA的检测，以及它在科学研究和临床上的应用打下了良好的基础。循环miRNA作为肿瘤的标志物具有广泛的应用前途。它具有检测的损伤小、灵敏度高等特点，还可以应用于肿瘤的早期诊断，理论上甚至可以在正常细胞恶变的过程当中发现，对于至今缺乏明确肿瘤标志物的许多实体肿瘤来说，具有良好的临床应用前景。但是目前这种检测还有很多缺点和不足。由于血液中miRNA的表达量较低，对检测试验的条件要求很高。目前国内外学者已经在许多肿瘤患者的血清中检测出表达异常的miRNA。但还没有膀胱癌病人血清的相关研究和开发。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供膀胱癌患者血清中循环miRNA标志物，建立膀胱癌患者血循环miRNA表达谱，揭示了血清miRNA对膀胱癌的诊断价值，为临
3床上膀胱癌患者的早期发现及早期治疗提供支持。为解决上述技术问题，本发明所涉及的膀胱癌血清miRNA检测及表达谱的建立方法，包括以下步骤
(1)用QIANGEN试剂盒从膀胱癌患者和正常人对照的血清中提取总RNA，通过TaqMan低密度芯片TLDA筛选出候选miRNA ；
(2)米用TaqManprobe-based qRT_PCR方法,扩大样本量对候选miRNA进行验证,建立膀胱癌血清miRNA表达谱。进一步的，米用ROC (receiver operator characteristic curve)分析方法评价血清miRNA表达谱对于膀胱癌患者的早期诊断以及不同临床分级、分期的膀胱癌患者的诊断价值。所述的膀胱癌的血清miRNA生物标志物在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。本发明还涉及检测膀胱癌血清miRNA的稳定内参，比较内源性内参U6和mir_16在膀胱；癌患者血清中表达的稳定性，其方法是(I)以外源性的cel-mir_39为内参，随机选择24例病例和匹配的24例对照血清，分别检测U6和mir-16在病例和对照中的表达是否存在差异；(2)随机选择3个病例，每个等分成4份，分别暴露于室温下0、l、2、4h后提取总RNA,比较同一样本在不同暴露时间下，U6和mir-16的表达是否存在差异。本发明首次发现血清miRNA作为一个重要的生物学检测指标，在膀胱癌临床早期诊断、鉴别诊断、有效观察中的作用，为今后泌尿系统肿瘤血清miRNA的研究提供了理论依据，并为从分子水平诊断膀胱癌提供了新的思想，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。
下面结合附图和本发明的实施方式进一步详细说明
图I :不同暴露时间下U6和miR-16在血清中表达的稳定性；
图2 miRNA在10对膀胱癌病例对照中的表达；
图3 :血清miR-663b和miR-497在膀胱癌病例和对照中的表达水平；
图4 =ROC曲线分析图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述的实施例，下面的实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。I、样本收集和RNA提取
收集56例新发膀胱癌病例，同时收集60例在年龄和性别上相匹配的对照。病例主要于医院收集的经过病理诊断病例。对照来自于健康非肿瘤病人。所有研究对象均签署知情同意书，并提供200uL血清。随机抽取10对年龄性别匹配的病例和对照，用QIANGEN试剂盒提取血清中总RNA做TaqMan低密度芯片(TLDA)，以芯片中ath-mir_159a和mir-16为内参，以Λ Λ CT绝对值大于5为标准，选出7个表达有差异的miRNA，同时，根据文献报道，选出miR-1作为候选miRNA与芯片筛选的7个miRNA —起进行大样本的验证。
2、样本的流行病学调查和临床资料
所有病人都经过两名病理医生的病理诊断，纳入本研究前未患其它肿瘤，且未经放射或化学药物治疗。病例和队长都使用统一的健康状况调查表，以面对面的方式对病例和对照进行现场流行病学调查。调查内容包括一般人口学特征、吸烟史、饮酒史、饮食、个人史和家族史等。吸烟者定义为每天吸烟超过I支并持续一年以上，累计吸烟量“包年”按(每日吸烟量/20) X吸烟年数来计算。饮酒者定义为每周至少3次，持续一年以上。所有调查人员均经过统一培训。3、血清miRNA表达量的检测方法
米用TaqMan probe-based qRT-PCR检测血清中miRNA的表达量(I)逆转录采用TaqMan miRNA逆转录试剂盒和miRNA特异性莖环结构(stem-loop)逆转录引物进行miRNA逆转录反应，具体操作参照ABI的流程，其中部分进行调整，反应体系包括3uL 5*的逆转录弓I物(同时加入5个逆转录弓I物，每次包含内参的逆转录弓丨物)、I. 5uL10*的逆转录缓冲液、O. 15uL IOOmmoI/L的dNTP和dTTP混合物、IuL逆转录酶(50U/uL)、O. 19uL的RNA抑制剂，共5. 84uL，每个反应体系中加入9. 16uLRNA，总反应体系为15uL。该方法的反应条件为16° C反应30分钟，42° C反应30分钟，最后85° C孵育5分钟。(2)实时荧光定量PCR:采用TaqMan探针法进行实时荧光定量PCR，具体操作参照ABI的流程，其中部分进行调整，反应体系包括0. 25uL 20*miRNA检测探针、2. 5uL2*Master Mix、1.25uL双蒸水、IuL稀释后的cDNA,共5uL,每个miRNA检测实施3平行。使用ABI Prism 7900荧光定量PCR仪检测，其反应条件95° C 10分钟、95° C15秒、60° Cl分钟，以上阶段进行40个循环。4、内参稳定性的验证
(I)以外源性的cel-mir-39为内参，随机选择24例病例和匹配的24例对照血清，分别检测U6和mir-16在病例和对照中的表达是否存在差异。(2)随机选择3个病例，每个等分成4份，分别暴露于室温下0、l、2、4h后提取总RNA,比较同一样本在不同暴露时间下，U6和mir-16的表达是否存在差异。5、分析几种miRNA在膀胱癌病例和对照中的表达水平
CT值代表了一种目的miRNA分子达到实验设计阈值所需要的PCR循环的次数，当CT值>35时，认为样本中不含有该miRNA。在目的miRNA与内参扩增效率相同的情况下可以直接得到目的miRNA相对于内参的定量Λ CT=CT目的-CT内参，Δ ACT=ACT^ij-ACTmo采用2_Δ Δετ表示病例组miRNA表达相对于对照组变化的倍数。使用SDS2. 3软件分析TLDA芯片数据，采用SPSS13. O软件做进一步的统计分析。6、分析miR_663b和miR-497对膀胱癌的诊断价值
绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC，来评价这两个miRNA分别诊断膀胱癌以及合并诊断膀胱癌的敏感性和特异性。7、结果
(I)研究对象的一般特征
病例-对照人群特征分布见表I所示，病例组和对照组在年龄构成、性别和吸烟情况上无显著性差异0°值分别为O. 968、O. 409和O. 212)。表I :膀胱病例-对照研究的一般人口学特征比较
权利要求
1.一种膀胱癌的血清miRNA生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为miR_663b或/ 和 miR-497。
2.权利要求I所述的膀胱癌的血清miRNA生物标志物在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。
3.—种如权利要求I所述的膀胱癌的血清miRNA生物标志物的检测及表达谱建立方法，包括以下步骤 (1)用QIANGEN试剂盒从膀胱癌患者和正常人对照的血清中提取总RNA，通过TaqMan低密度芯片TLDA筛选出候选miRNA ； (2)米用TaqManprobe-based qRT_PCR方法,扩大样本量对候选miRNA进行验证,建立膀胱癌血清miRNA表达谱。
4.如权利要求3所述的膀胱癌的血清miRNA的检测及表达谱建立方法，其特征在于，采用ROC分析方法评价血清miRNA表达谱应用于膀胱癌患者的早期诊断以及不同临床分级、分期的膀胱癌患者的诊断。
5.一种如权利要求I或2所述的膀胱癌的血清miRNA生物标志物表达量的检测方法，该方法采用TaqMan probe-based qRT-PCR检测血清中miRNA的表达量,包括以下步骤 (1)逆转录采用TaqManmiRNA逆转录试剂盒和miRNA特异性莖环结构(stem-loop)逆转录引物进行miRNA逆转录反应，具体操作参照ABI的流程，其中部分进行调整，反应体系包括3uL 5*的逆转录引物，同时加入5个逆转录引物，每次包含内参的逆转录引物，I. 5uL10*的逆转录缓冲液、O. 15uL IOOmmoI/L的dNTP和dTTP混合物、IuL逆转录酶(50U/uL)、O.19uL的RNA抑制剂，共5. 84uL，每个反应体系中加入9. 16uLRNA,总反应体系为15uL，反应条件为16° C反应30分钟，42° C反应30分钟，最后85° C孵育5分钟； (2)实时荧光定量PCR:采用TaqMan探针法进行实时荧光定量PCR，具体操作参照ABI的流程，其中部分进行调整，反应体系包括0. 25uL 20*miRNA检测探针、2. 5uL 2*MasterMix、1.25uL双蒸水、IuL稀释后的cDNA，共5uL，每个miRNA检测实施3平行，使用ABIPrism 7900荧光定量PCR仪检测，其反应条件95° C 10分钟、95° C 15秒、60° C I分钟，以上阶段进行40个循环。
全文摘要
本发明涉及血清miRNA用于检测膀胱癌的生物标志物，克服现有技术中的不足，提供膀胱癌患者血清中循环miRNA标志物，建立膀胱癌患者血循环miRNA表达谱，揭示了血清miRNA对膀胱癌的诊断价值，为临床上膀胱癌患者的早期发现及早期治疗提供支持。本发明首次发现血清miRNA尤其是miR-663b和miR-497作为一个重要的生物学检测指标，在膀胱癌临床早期诊断、鉴别诊断、有效观察中的作用，为今后泌尿系统肿瘤血清miRNA的研究提供了理论依据，并为从分子水平诊断膀胱癌提供了新的思想，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。
文档编号G01N21/64GK102925444SQ201210453019
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者张正东, 王美林, 石丹妮, 储海燕, 马兰, 仝娜, 吴冬梅 申请人:南京医科大学