一种新型的乳腺癌量子点免疫层析试纸条的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米材料肿瘤诊断技术领域，特别涉及一种新型的乳腺癌量子点免疫层析试纸条的制备方法。
【背景技术】
[0002]血清肿瘤标志物的检测已经越来越引起人们的关注，这是因为这种方法具有很多优点，如简便无创，可以重复检测，检测结果直观且可以定量，费用相对较低等等。最重要的一点是对于血清肿瘤标志物可以动态监测，从而可以对恶性肿瘤的诊断、病情发展与疗效等进行判断，在临床上具有很高的应用价值。
[0003]这些物质在正常人的体内不存在，或者在正常人体内出现的水平显著低于肿瘤患者体内的水平。一般来说，一种理想的肿瘤标志物需要满足以下条件:特异性强，灵敏度高，能够对肿瘤进行定位，与肿瘤的大小或分期相关，能够对肿瘤的疗效和预后进行判断，具有相当高的预测价值等。但是，目前所应用的肿瘤标志物并不能同时满足上述所有要求，因此需要人们合理使用，并且正确评价其对临床上进行肿瘤检测的意义与价值。由于目前临床上常用的肿瘤标志物没有足够高的灵敏度，且特异性不够强，因此在对恶性肿瘤进行诊断时，不能排除假阴性的结果，所以肿瘤标志物并不能够确诊，即不能作为肿瘤诊断的主要依据，而只是作为恶性肿瘤检测时的一种辅助手段，需要结合其他检测方法进行确诊。肿瘤标志物对正常人群普查时必须要考虑到该肿瘤的发病率以及检测方法的灵敏度、特异性以及对检测结果的重复性问题。除此之外，还应该考虑到实际条件的制约，如普查的费用是否合理，能否被大多数人接受，或者说该肿瘤的早期治疗比晚期治疗更经济有效。由于绝大多数肿瘤标志物并不具有器官特异性，只有前列腺特异性抗原PSA、甲胎蛋白AFP和甲状腺球蛋白等极少数的肿瘤标志物有一定的器官定位作用，但这也不是肿瘤特异性，因此肿瘤标志物阳性不能对肿瘤进行绝对定位。肿瘤标志物的浓度与肿瘤的大小相关，且大多与肿瘤的分期存在关联，因此对判断肿瘤临床分期具有一定的意义。但是每个个体来说，各期肿瘤的肿瘤标志物的浓度范围很大，并且彼此之间会互相发生重叠，因此肿瘤标志物的个体测得值并不能直接判断出肿瘤大小，也不能用来确定肿瘤分期，只具有一定的指示作用。肿瘤标志物对肿瘤的治疗疗效和复发监测具有一定的临床价值。临床上，通过检测肿瘤患者治疗前后肿瘤标志物的浓度变化可以判断对肿瘤的治疗是否有效。如果治疗后患者的肿瘤标志物的浓度下降到正常值范围内，则表明对肿瘤的治疗有效；如果治疗后患者的肿瘤标志物的浓度虽然有所下降，但仍然高于正常值范围，则表明肿瘤还有残留，或者肿瘤已经发生转移；如果治疗后患者的肿瘤标志物的浓度下降到正常值范围内，但是经过一段时间，肿瘤标志物的浓度再次上升并高于正常值，这表明肿瘤复发或者肿瘤转移。根据上述几种判断标准，可以判断肿瘤预后，为进一步治疗提供参考依据。
[0004]基于上述几种考虑，目前医务工作者们大多采用几种肿瘤标志物联合检测的原贝1J，这是因为患有一种肿瘤时可能有一种或几种肿瘤标志物异常，并且同一种肿瘤标志物异常可以出现在不同的肿瘤中。但是联合检测的指标必须经过科学分析以及严格筛选，综合考虑各种肿瘤标志物的灵敏度和特异性等因素作出合理选择。目前临床上常用的肿瘤标志物有 AFP、CEA、PSA、HCG、NSE、CA199、CA12-5 以及 CA15-3 等。CA15-3 是乳腺癌的最重要的特异性标志物，30% -50%的乳腺癌患者的CA15-3明显升高，其含量的变化与治疗效果密切相关，是乳腺癌患者诊断和监测术后复发、观察疗效的最佳指标，CA15-3动态测定有助于II期和III期乳腺癌病人治疗后复发的早期发现。CEA是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，其特异性不强，灵敏度不高，对肿瘤早期诊断作用不明显，但对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。
[0005]对生物体内的肿瘤标志物实现高灵敏度的检测是生命科学领域研究的一项重要课题，发展一种新的灵敏度高的检测方法也成为研究者们努力的目标。在众多的检测方法中，利用荧光分析检测受到了人们的广泛关注，而荧光分子检测中的检测限主要取决于所选用的荧光标记物的发光强度。目前，量子点因具有优异的光学性质已经被广泛应用于示踪、成像以及标记等方面。而免疫层析试纸条检测则因为它的简单迅速、价格低廉、可以随时随地等优点在检测领域处于特殊重要的地位。因此我们拟在已有量子点试纸条检测肿瘤标志物的基础上，同时检测两种或两种以上的肿瘤标志物，实现量子点试纸条检测肿瘤标志物的多元检测。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种新型的乳腺癌量子点免疫层析试纸条的制备方法，通过不同发射波长量子点进行编码，根据量子点的荧光性质和肿瘤标志物浓度之间的关系，在试纸条上同时检测两种或两种以上的肿瘤标志物，实现量子点试纸条检测肿瘤标志物的多元定量检测。选定CA15-3和CEA这两种肿瘤标志物，建立一种乳腺癌量子点试纸条检测的新方法，对乳腺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计都有重要意义。
[0007]本发明的技术方案如下：
[0008]1)将量子点QDs625nni和QDs 560nn, EDC(1-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)加入反应器，反应体系为PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
[0009]2)将糖类抗原15-3标记抗体（CA15-3Abi)和免疫量子点QDs625nni混合，反应体系为PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体2?3h，离心得到量子点_糖类抗原15-3标记抗体（QDs-CAlSIAbi)的荧光探针，加入牛血清白蛋白BSA。
[0010]3)将癌胚抗原标记抗体（CEAAbi)和免疫量子点QDs56Qnni混合，反应体系为PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体2?3h，离心得到量子点-癌胚抗原CEA标记抗体(QDs-CEAAbi)的荧光探针，加入牛血清白蛋白BSA。
[0011]4)试纸条制备：用处理液处理样品垫和结合垫并37°C烘干，然后用上述荧光探针再次处理结合垫并37°C烘干，将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到乳腺癌量子点免疫层析试纸条。
[0012]量子点：EDC质量分数配比为1:4000?10000。
[0013]量子点和标记抗体质量分数比=1:20?50。
[0014]所述PBS缓冲液用以保持癌胚抗原抗体和糖类抗原15-3抗体的活性。
[0015]所述牛血清白蛋白(BSA)用以封闭荧光探针上未反应的羧基。
[0016]所述处理液是蔗糖、牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG、聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯Tween-20的混合溶液。
[0017]所述制备方法，其特征在于同时选用不同发射波长的量子点QDs625nni和QDs 56_检测不同的肿瘤标志物CA15-3和CEA，如说明书附图5所示。
[0018]根据试纸条夹心结构捕获的量子点荧光强度和抗原浓度之间的关系，实现对两种肿瘤标志物的定性定量检测，如说明书附图3、4、5所示。不同CEA和CA15-3标准抗原浓度优选O?1000ng/mL(其中Ong/mL对应胎牛血清FBS，作为阴性对照)。
[0019]CA 15-3包被抗体匀喷在硝酸纤维素膜上作为检测线T i，将CEA包被抗体Ab2均匀喷在硝酸纤维素膜上作为检测线T2，而将羊抗鼠抗体Ab3硝酸纤维素膜上作为质控线Co两种量子点荧光探针和其相对应的肿瘤标志物抗原Ag以及包埋在试纸条的另一种肿瘤标志物单抗Ab2，形成一种类似夹心的结构QDs-Ab1-Ag-Ab2,或者形成QDs-Ab1-Ab3结构。如果检测样品仅有CA15-3抗原存在，则T1线和C线亮而T 2线不亮；如果检测样品仅有CEA存在，则T2线和C线亮而T:线不亮；如果检测样品同时含有CA15-3和CEAJj T:线、T 2线和C线均亮；如果检测样品既没有CA15-3也没有CEA，则T1线和T 2线均不亮而C线亮。
[0020]本发明涉及了一种新型的乳腺癌量子点免疫层析试纸条的制备方法。EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)活化羧基下采用发射波长在625nm左右的CdSe/ZnS红色量子点和发射波长在560nm左右的CdSe/ZnS绿色量子点分别偶联CA15-3 (carbohydrate antigenl5-3)和 CEA (carcino-embryonic antigen)肿瘤标志物的单抗Ab1,形成两种量子点荧光探针QDs625nn1-CA15-3AbdP QDs ^50nn1-CEAAb1。两种量子点荧光探针和其相对应的肿瘤标志物抗原Ag以及包埋在试纸条的另一种肿瘤标志物单抗Ab2,形成一种类似夹心的结构QDs-Ab1-Ag-Ab2，通过这种方法量子点试纸条可以同时检测两种及两种以上的肿瘤标志物，建立了一种新型的乳腺癌量子点免疫层析试纸条的制备方法。与现有产品和技术相比，本发明的特点在于:可同时检测两种肿瘤标志物，大大简化了检测步骤，