一种检测花生过敏原的表面等离子共振法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测花生过敏原的表面等离子共振法。
【背景技术】
[0002]FA0/WH0认定的导致人类食物过敏的八大类食品中，花生及其制品就是其中之一。在欧美的食品标签法中也规定了花生是必须标示的食物过敏原成分。Ara hi蛋白是花生中的最主要过敏原。
[0003]花生过敏原的检测方法主要是针对花生中特异性过敏原蛋白质或编码过敏原的DNA片段为检测目标。因此，检测方法主要分为两类:以检测基因为基础的方法和以检测蛋白为基础的方法。以检测基因为基础的方法是依赖聚合酶链式反应(PCR)来扩增特定的DNA片段，这类方法有定性PCR和实时荧光定量PCR (Real-time PCR)等。定性PCR主要是通过掺入荧光染料的琼脂糖电泳来检测是否存有花生的特异性DNA。更好的DNA检测方法就是Real-time PCR，可以利用特异性探针提高检测的特异性。另外还有RT-PCR法，这一方法需要严格的实验操作，商业上得不到广泛应用。以检测蛋白为基础的方法是检测出花生的总蛋白或特异的花生过敏原，这类方法通常包括免疫分析检测方法，如 DI (Dot Immunoblotting)、RAST(Rad1-allergosorbent test)、RIE (Rocketimmuno-electrophoresis)、ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)、DSA(Dip stickassay)和 LFIA(lateral flow immunoassay)等。其中，DI，DSA 和 LFIA 是定性和半定量方法，DSA通过连续的三步完成整个过程，耗时30min至3h ;而LFIA仅通过一步完成，耗时约5min至1min ;RIE需要电泳和免疫杂交，操作耗时，后期得不到广泛使用。RAST和ELISA是定量分析方法。ELISA因其准确性高和易操作，在常规食品分析中常用。这些方法取决于所用抗体的特异性与灵敏度。
[0004]当前商用的花生过敏原成分检测主要有三种方法:ELISA，胶体金法(LFIA)和实时荧光定量PCR法。ELISA和LFIA的蛋白检测方法主要是检测食品中的花生总蛋白或花生主要过敏原(Ara hi或Ara h2)，ELISA的检测出限(LOD) —般是稍低于5ppm，LFIA的LOD一般约为5ppm。ELISA的检测所用时间大约2h，LFIA所用的约lOmin。与LFIA相比，ELISA更为灵敏，但需要较多的操作时间^ELISA相比，LFIA不需要额外的检测仪器，更为简易，快速，并节约成本。但是，LFIA仅能提供是/否的检测结果，而ELISA可以半定量或全定量检测。商用的实时荧光定量PCR试剂主要是检测食品中的花生主要过敏原基因(Ara h 2)DNA 水平，需要 lh, LOD 约 10_50ppm。
[0005]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0006]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，旨在解决现有检测方法存在的耗时耗力，灵敏度不高及对低剂量的过敏原检测不出或成本太高的问题。
[0007]本发明的技术方案如下:
一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，包括步骤:
A、制备花生Arahi蛋白；
B、以花生Arahi蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗花生Ara hi多克隆抗体；
C、以花生Arahi蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗花生Ara hi单克隆抗体；
D、通过偶联的方法将抗花生Arahi单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的花生Ara hi蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗花生Ara hi多克隆抗体用于放大信号，得到检测结果。
[0008]所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤A具体包括:对花生进行丙酮去脂处理，然后通过PBS缓冲液对去脂后的花生进行花生蛋白提取，得到花生蛋白粗提液，最后通过硫酸铵分级沉淀及阴离子交换层析法分离出花生蛋白粗提液中的花生Ara hi蛋白。
[0009]所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B具体包括:以花生Ara hi蛋白作为抗原，将花生Ara hi蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，冋时将花生Ara hi蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后夹动物眼球取血，离心取血清，制得抗花生Ara hi多克隆抗体。
[0010]所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B之后还包括:对抗花生Ara hi多克隆抗体进行效价测定、纯化及特异性测定。
[0011]所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤C具体包括:以花生Ara hi蛋白作为抗原，将花生Ara hi蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，冋时将花生Ara hi蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后取免疫后的动物脾细胞与骨髓瘤细胞混合，通过PEG法进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行筛选与克隆，制得抗花生Ara hi单克隆抗体。
[0012]所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤C还包括对抗花生Ara hi单克隆抗体进行纯化处理，所述纯化处理具体包括:用花生Ara hi蛋白为革E抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应，取阳性杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成I X 106/mL，接种动物腹腔每只0.5mL，待8?1d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，纯化腹水，得到两株抗花生Ara hi单克隆抗体，分别命名为2G9和5G4。
[0013]所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤C还包括采用免疫印迹法对抗花生Ara hi单克隆抗体进行鉴定，并采用不同的抗IgG类型单抗对抗Ara hi单克隆抗体进行抗体类型测定。
[0014]所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤D具体包括步骤:
D1、将抗花生Ara hi单克隆抗体固定于检测芯片上；
D2、以3~7 μ L/min的流速注射花生Ara hi蛋白流经检测芯片280~320s ；
D3、以3~7 μ L/min的流速注射HBS-EP缓冲液平衡检测芯片表面150~200s ；
D4、以3~7 μ L/min的流速注射抗花生Ara hi多克隆抗体用于放大信号；
D5、以 25~35yL/min 的流速注射8~10mM Glycine-HCl 25~35s，3 次用于抗花生Ara hi单克隆抗体的表面；
在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代花生Ara hi蛋白作为样本零浓度用来检测 LOD0
[0015]所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤Dl中，所述抗花生Ara hi单克隆抗体的固定具体包括步骤:
Dl1、注射HBS-EP缓冲液，以8~12 μ L/min的流速平衡检测芯片表面4~7min ；
D12、注射NHS与EDC的混合液，以8~12 μ L/min的流速活化检测芯片表面5~10min ； D13、注射抗花生Ara hi单克隆抗体，以8~12 μ L/min的流速偶联检测芯片5~10min ； D14、注射乙醇胺，以8~12 μ L/min的流速封闭检测芯片表面5~10 min。
[0016]所述的检测花生过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤D2中，用HBS-EP缓冲液将花生 Ara hi 蛋白稀释为 5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL的不同浓度的花生Ara hi蛋白。
[0017]有益效果:本发明利用抗花生Ara hi单克隆抗体作为固定抗体，捕抓花生Ara hi蛋白，再通过抗花生Ara hi多克隆抗体进行信号放大，达到快速高效进行检测花生主要过敏原蛋白的目的。本发明方法同时结合了双抗体夹心ELISA方法的特异性和SPR快速高效的特征，从而达到高效、准确、便捷的检测效果。
【具体实施方式】
[0018]本发明提供一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019]本发明提供一种检测花生过敏原的表面等离子共振法，其包括步骤:
A、制备花生Arahi蛋白；
B、以花生Arahi蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗花生Ara hi多克隆抗体；
C、以花生Arahi蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗花生Ara hi单克隆抗体；
D、通过偶联的方法将抗花生Arahi单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的花生Ara hi蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗花生Ara hi多克隆抗