体用于放大信号，得到检测结果。
[0020]表面等离子共振(SPR)法基于光学技术原理通过分析分子间相互作用信息，能够实时检测一种或多种分子之间的反应，是一种新型食品过敏原检测方法。此SPR方法无背景干扰，对样品的纯化程度较低，使用简单、快速、无需标记、灵敏度高。
[0021]本发明利用SPR方法检测花生主要过敏原花生Ara hi蛋白。具体分别制备抗花生Ara hi单克隆抗体和抗花生Ara hi多克隆抗体，然后通过偶联的方法将抗花生Ara hi单克隆抗体固定在检测芯片上，将不同浓度的花生Ara hi蛋白流经检测芯片，加入抗花生Ara hi多克隆抗体用于放大信号，从而达到快速高效检测花生主要过敏原蛋白的目的。本发明方法具有灵敏度高、准确度高、检测快捷等特点。
[0022]下面通过一具体实施例对本发明上述技术方案进行详细说明。
[0023]一、花生Ara hi蛋白的制备 1、丙酮去脂
用飞利浦豆浆机将200g干燥的天然的花生粉碎，再将花生粉末置于500 mL的烧杯中，加入适量丙酮，于4°C冰箱中磁力搅拌两小时，反复多次去脂，直至上清液澄清为止。然后倒去丙酮，将去脂花生粉末于通风橱中使丙酮风干，风干后得脱脂花生粉末。
[0024]2、花生蛋白的粗提
称量花生粉末，按每克样品7 mL加入PBS缓冲液进行蛋白提取，4°C磁力搅拌24 h。提完后用冷冻离心机在15000 r/min，4°C条件下离心15 min，上清液即为花生过敏原粗提液。
[0025]3、硫酸铵分级沉淀
将花生过敏原粗提液置于烧杯中，在磁力搅拌的情况下缓慢加入硫酸铵直至饱和度达到30%，待完全溶解，将粗提液在4°C下12000r/min离心lOmin。沉淀用适量的PBS完全溶解；按相同的操作使离心后的上清液的硫酸铵浓度达到70%，第三次达到100%。硫酸铵三次分级沉淀所得的蛋白溶液于4 °C冰箱中保存。
[0026]4、阴离子交换层析法分离花生Ara hi蛋白
平衡缓冲液、洗脱缓冲液的制备:平衡缓冲液含8M尿素，20mM的Tris-HCl (pH8.0)。洗脱缓冲液与平衡缓冲液配制方法相同，除多加600mM的NaCl。
[0027]过层析柱蛋白样品的制备:先将硫酸铵沉淀的蛋白样品ImL混合3mL的平衡缓冲液，于15 mL的MILLIPORE超滤离心管中超滤离心，5000 r/min离心lOmin。倒去滤液，再添加平衡缓冲液3mL，超滤离心，如此反复5次。使蛋白样品溶液与平衡缓冲液相似，最终样品体积为lmL。
[0028]在AKTApurifier全自动层析仪系统(GE公司)，采用强阴离子交换层析MonoQ5/50 GL进行蛋白分离纯化，花生蛋白上柱后，用洗脱缓冲液以O?600mM/NaCl连续梯度洗脱，280nm检测紫外吸收峰，收集各洗脱峰。
[0029]5、SDS-PAGE 电泳分析
采用不连续体系SDS-PAGE电泳平板凝胶，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12 %，先用80V恒压电泳15min，然后120V恒压跑电泳。电泳结束后经考马斯亮蓝R250染色、醋酸脱色。
[0030]6、花生Ara hi蛋白浓度的测定
采用BCA法，用BCA蛋白含量试剂盒，配制出不同浓度的标准花生Ara h I蛋白溶液。用紫外分光光度计在562nm处分别测定不同浓度标准花生Ara hi蛋白溶液的吸光值，以吸光度值(A562)为纵坐标，标准蛋白含量(ug/uL)为横坐标，绘制标准曲线。
[0031]7、免疫印迹法鉴定花生Ara hi蛋白
取1uL的纯化蛋白液进行SDS-PAGE电泳，电泳完后取出SDS-PAGE凝胶，按凝胶的大小剪取硝酸纤维素膜(NC膜)，然后在350 mA条件下，于4°C冰箱中转膜50min。取下NC膜用3 % BSA于4°C冰箱中封闭过夜，加入过敏病人的阳性混合血清(按1:10稀释)。摇床上摇2h后，将NC膜转入生物素标记羊抗人IgE抗体(按1:1500稀释)中摇2h。链霉亲和素(HRP)按1:1000稀释后将NC膜放入其中摇2h。最后DAB显色，待条带清晰后即用水冲洗，终止显色反应。。
[0032]二、抗花生Ara h I多克隆抗体制备 1、首次免疫
取100 Pg花生Ara hi蛋白和等体积的福氏完全佐剂混合乳化后，皮下注射小鼠颈背部。加强免疫共2次，蛋白量同前，混入等量的福氏不完全佐剂。每次免疫间隔约3周，第3次免疫后，第5天，采取夹眼球取血，离心取血清。对于抗花生Ara hi多克隆抗体的鉴定采用了免疫印迹法(Western-blotting)鉴定，先用提取的花生Ara hi蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后电转到硝酸纤维素膜上，用免疫后小鼠血清为一抗，以免疫前小鼠血清为阴性对照，用标记HRP的羊抗鼠IgG的抗体为二抗，用DAB显色。
[0033]2、抗花生Ara hi多克隆抗体的效价测定与纯化
采用常规的间接ELISA法进行检测，提取的花生Ara hi蛋白按10ng/孔4°C包被过夜，封闭液为2%BSA-PBST，37°C封闭2h，以获取的多抗血清为一抗，同时用免疫前小鼠血清做平行阴性对照试验，从1:100开始对倍稀释，37°C反应lh，PBST洗三次后，加入抗鼠IgG-HRP作为二抗，37°C反应lh，洗三次后加底物TMB显色。测定孔OD值与阴性对照孔OD值之比大于2.1为阳性判断标准，抗体的稀释度即为抗体的效价。鉴定与效价测定后，采用夹眼球取血，离心取血清，用于血清抗体纯化。抗体纯化参照HiTrap protein G亲和层析说明书进行。
[0034]3.抗花生Ara hi多克隆抗体的特异性测定
用间接ELISA检测该抗花生Ara hi多克隆抗体能否认别一些坚果类(杏仁、胡桃、核桃、榛子和开心果)、一些豆类品(大豆、蚕豆、豌豆、黑豆、绿豆、红豆)和葵花种子、小麦、乔麦、黑麦、鸡蛋、牛奶、芝麻、虾、鱼等蛋白。每孔按10ng蛋白/孔4°C包被过夜，封闭液为2%BSA-PBST，37°C封闭2h，以该抗花生Ara hi多克隆抗体为一抗，同时用花生Ara hi蛋白为阳性对照，以PBS为阴性对照。
[0035]三、抗花生Ara hi单克隆抗体制备
1、抗花生Ara hi单克隆抗体的制备与其纯化
先用纯化后花生Ara hi蛋白免疫BAL B/C小鼠，具体要求按照多抗制备过程中的动物免疫，然后取用纯化花生Ara hi蛋白免疫后的BAL B/C小鼠的脾细胞，将与NS-1鼠骨髓瘤细胞按2: I的比例混合，用PEG法进行细胞融合。加到已有饲养细胞层的96孔板内，置37°C、5%0)2培养箱中培养。HAT选择培养，筛选出所需要的杂交瘤细胞系，阳性孔经4次亚克隆后，选取最后克隆扩大培养，生产抗体。用间接免疫酶标法筛选阳性克隆及亚类鉴定。用纯化花生Ara hi蛋白为靶抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应。取生长良好的杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成I X 106/mL,接种小鼠腹腔每只0.5mL，待8?1d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，-20°C保存备用。腹水中单抗的纯化参照用抗体纯化的Protein G亲和交换层析柱(GE公司)说明书。主要得到两株抗Ara hi抗体，分别命名为2G9和5G4。
[0036]2、抗花生Ara hi单克隆抗体的鉴定、抗体类型和抗体效价的测定
对于抗花生Ara hi单克隆抗体的鉴定采用了免疫印迹法(Western-blotting)鉴定，先用提取的花生Ara hi蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后电转到硝酸纤维素膜上，用纯化后的抗花生Ara hi单克隆抗体为一抗，以免疫前小鼠血清为阴性对照，用标记HRP的羊抗鼠IgG的抗体为二抗，显色。采用不同的抗IgG类型单抗对纯化后的抗花生Ara hi单克隆抗体进行抗体类型测定。采用常规的间接ELISA法进行检测，天然的花生过敏原蛋白Ara hi按10ng/孔4°C包被过夜，封闭液为3%BSA-PBST，37°C封闭2h，以纯化后的抗花生Ara hI单克隆抗体为一抗，同时用免疫前小鼠血清做平行阴性对照试验，从1:100开始对倍稀释，37°C反应lh，PBST洗三次后，加入抗鼠IgG-HRP作为二抗，37°C反应lh，洗三次后加底物TMB显色。测定孔OD值与阴性对照孔OD值之比大于2.1为阳性判断标准，抗体的稀释度即为抗体的效价。
[0037]3、抗花生Ara hi单克隆抗体的特异性测定
用间接ELISA检测该两株抗花生Ara hi单克隆抗体(2G9和5G4)能否认别一些坚果类(杏仁、胡桃、核桃、榛子和开心果)、一些豆类品(大豆、蚕豆、豌豆、黑豆、绿豆、红豆)和葵花种子、小麦、乔麦、黑麦、鸡蛋、牛奶、芝麻、4下、鱼等蛋白。每孔按10ng蛋白/孔4°C包被过夜，封闭液为2%BSA-PBST，37°C封闭2h，以该抗体为一抗，同时用花生蛋白为阳性对照，以PBS为阴性对照。
[0038]四、SPR检测
本实验使用SPR方法(GE Healthcare，BI