基于透明质酸修饰的表面等离子共振仪芯片及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于透明质酸修饰的表面等离子共振仪芯片及其制备方法。透明质酸修饰芯片的结构依次为玻璃层、铬层、金膜层、巯基醇单分子层和透明质酸层组成。在金膜表面上用巯基十一醇修饰，形成自组装单层。然后经环氧氯丙烷环氧化之后浸入透明质酸溶液中，共价修饰一层透明质酸，进而采用溴乙酸进行羧基化，获得一种基于透明质酸的表面等离子共振仪芯片。本发明的芯片在单一蛋白、天然复杂样品以及10％的血清中有优良的抗污染性能，并且对生物大分子抗体具有高固载量和良好的相容性，实现复杂蛋白体系中目标分子的高特异性、灵敏快速检测。本发明的芯片具有优良的抗污染性能、且原料成本低、制备方法易于操作，有很好的经济可行性和实用性。
【专利说明】基于透明质酸修饰的表面等离子共振仪芯片及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于透明质酸修饰的表面等离子共振仪芯片及其制备方法，属于 表面等离子共振谱仪抗污染芯片的设计和制备方法。
【背景技术】
[0002] 表面等离子共振（surface plasmon resonance,简称SPR)谱仪因其具有简便、快 速、高灵敏等优点，被国外大型仪器公司普遍看好，并已开始进行大规模研发，已发展成为 定性或定量测量分子相互作用的有力工具，受到广大科研人员、大型药物企业关注和重视， 已被广泛应用于生物技术、医疗检测、环境科学、食品安全、药物筛选、材料分析等诸多领 域。
[0003] SPR芯片（如目前应用较多的美国通用公司的CM5系列，在裸金膜上连接上一层葡 聚糖）是表面等离子共振谱仪最为核心的组件，提供产生SPR信号的必需物理条件，主要包 括耦合器件、金属膜和表面基质等。SPR芯片上非特异性吸附是SPR分析的普遍存在问题， 这是由芯片表面的化学性质、结构、电负性以及亲水性决定。未做任何修饰的裸金芯片，由 于表面极其疏水，若直接应用于检测，会吸附上一层非待检测物。目前较常见的葡聚糖修饰 的SPR芯片，就是在裸金表面修饰一层葡聚糖，使得芯片获得良好的亲水性，氢键产生的水 合作用会在一定程度上抑制杂质蛋白的吸附。然而该芯片仅仅对于单一蛋白溶液具有良好 的抗吸附性能，对于较复杂的体系，如豆浆，牛奶等基本上不能满足要求。另一方面由于国 外公司的垄断，葡聚糖系列芯片价格昂贵。因此，研发具有抗污染性能的SPR芯片，降低表 面的非特异性吸附，提高检测准确性和精确度成为专家学者们亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一种基于透明质酸修饰的表面等离子共振仪芯片及其制备 方法。透明质酸层因具有更好的亲水性，产生较强的水亲和力，因此具有很好的抗非特异性 蛋白吸附的性能，尤其对于实际样品检测，如豆浆，牛奶及稀释的血清等复杂溶液体系。且 该芯片制备成本低、方法过程简单。本发明是通过以下技术方案加以实现的。
[0005] 本发明的一种基于透明质酸的表面等离子共振仪芯片；其透明质酸修饰芯片的结 构依次为玻璃层、铬层、金膜层、巯基醇单分子层和透明质酸层组成。
[0006] 所述BK7玻璃层厚度优选为0. 3-0. 7毫米。所述铬层厚度优选为2-3纳米。所述 金膜层厚度优选为45-50纳米。所述巯基醇层为单分子层。所述透明质酸层厚度优选为 6-15纳米。
[0007] 本发明的基于透明质酸的表面等离子共振仪芯片制备方法，包括以下步骤：
[0008] a)裸金芯片制备
[0009] 通过真空溅射在BK7玻璃基底上先涂覆2-3nm厚铬层，再涂覆45-50nm厚金膜，获 得了裸金芯片；
[0010] b)裸金芯片预处理
[0011] 将步骤a)获得的裸金芯片浸入浓硫酸与双氧水体积比1:0. 4-1:1的混合溶液中， 常温下浸泡l-6h ;然后取出用去离子水清洗直至表面无硫酸及双氧水残留，再用氮气吹 干；
[0012] c)巯基醇修饰
[0013] 用无水乙醇配制浓度为5-10mM的11-巯基-1-十一醇溶液；将步骤b)获得的裸 金芯片浸入上述11-巯基-1-十一醇溶液中，常温下浸泡6-15h后取出，在金膜表面形成了 巯基醇自组装单层；用乙醇和去离子水清洗直至未结合到金膜表面巯基醇被清洗干净，再 用氮气吹干；
[0014] d)透明质酸修饰
[0015] 1)用二乙二醇二甲醚配制浓度为0.6M的环氧氯丙烷溶液；将步骤c)获得的芯片 浸入上述环氧氯丙烷溶液中，常温下浸泡2-8h后取出；用去离子水清洗掉残留的环氧氯丙 烷及二乙二醇二甲醚，再并用氮气吹干；
[0016] 2)用0. 1M的氢氧化钠溶液配制浓度为1-lOmg/mL、分子量为10-2000kDa的透明 质酸溶液；将步骤1)获得的芯片浸入上述透明质酸溶液中，常温下浸泡5-24h后取出；用 去离子水洗掉未反应的透明质酸，并用氮气吹干备用；
[0017] e)羧基化改性
[0018] 用1M的氢氧化钠溶液配制浓度为1M的溴乙酸溶液；将步骤d)获得的芯片浸入上 述溴乙酸溶液中，常温下浸泡8-24h，在自组装单层表面修饰了一层透明质酸层。用去离子 水清洗并用氮气吹干。
[0019] 所述的金膜用银膜、银/金复合膜替换。所述的透明质酸分子量为10-2000kDa，浓 度为1-lOmg/mL。但不局限其分子类型和来源。
[0020] 本发明的方法制备的透明质酸修饰的裸金芯片，且具有良好的抗蛋白吸附性能， 到目前为止是没有人报道过的，并且我们还对其进行了实际应用-检测豆浆中的牛血清白 蛋白，验证该芯片具有良好的非特异性识别能力。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 1)本发明研制的基于透明质酸SPR芯片具有很好的抗污染性能，在溶菌酶、牛血 清蛋白、豆楽、牛奶和橙汁中非特性吸附量分别为4. 6ng/cm2、7. 7ng/cm2、0. 6ng/cm2、9. 8ng/ cm2和16. lng/cm2,见附图2。同时，在连接生物识别分子（牛血清白蛋白抗体）后，该芯片 的抗污染性能没有发生明显的变化，在溶菌酶、豆浆、牛奶、10%血清及100%血清中非特性 吸附量分别为 〇· 67ng/cm2、2. 5ng/cm2、17ng/cm2、16ng/cm2 和 60ng/cm2,见附图 3。
[0023] 2)本发明研制的基于透明质酸SPR芯片具有高稳定性，干燥状态下储存4个月或 PH7. 4磷酸盐缓冲液中储存7天后，抗污染性能无变化。
[0024] 3)本发明研制的基于透明质酸SPR芯片具有高固载量和生物相容性，以牛血清蛋 白抗体（anti-BSA)为例，固载量达780ng/cm 2 ;该传感芯片具有高特异性，以15nM牛血清蛋 白为目标物，以溶菌酶和豆浆为参考蛋白，信噪比分别达到了 94. 6和25. 8,见附图4。
[0025] 4)在本发明研制的基于透明质酸SPR芯片上固定牛血清蛋白抗体，在15-700nM范 围内实现了牛血清蛋白的定量检测，见附图5。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1基于透明质酸修饰的SPR芯片；其中，1-玻璃片基底，2-铬层，3-金膜层，4-巯 基醇单分子层，5-透明质酸层。
[0027] 图2透明质酸基芯片对溶菌酶（lmg/mL)、牛血清蛋白（lmg/mL)、豆楽（10mg/mL)、 牛奶（30mg/mL)和橙汁（10mg/mL)溶液中的非特异性吸附量。
[0028] 图3固载牛血清蛋白抗体的透明质酸基SPR芯片在溶菌酶（lmg/mL)、豆楽（10mg/ mL)、牛奶（30mg/mL)、10%血清及100%血清中的非特异性吸附量。
[0029] 图4固载牛血清蛋白抗体的透明质酸基SPR芯片在单一蛋白和复合蛋白体系中的 检测结果。其中，溶菌酶lmg/mL ;豆楽10mg/mL ;牛血清蛋白15nM ;牛血清蛋白15nM+溶菌 酶lmg/mL ;牛血清蛋白15nM+豆楽10mg/mL。
[0030] 图5固载牛血清蛋白抗体的透明质酸基SPR芯片定量检测牛血清蛋白的标准曲 线。
[0031] 图6本发明制备基于透明质酸修饰的表面等离子共振仪芯片的流程示意图。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1
[0033] 通过真空溅射在BK7玻璃基底上先涂覆一层2nm厚铬层，再涂覆一层48nm厚金膜 或者金银合金（任意混合比例），获得了裸金芯片。将裸金芯片浸入浓硫酸与双氧水（体积 比1:0. 4)混合溶液中，常温下浸泡3h。然后取出用去离子水清洗再用氮气吹干。将干燥后 的裸金芯片浸入5mM的11-巯基-1- i^一醇溶液（乙醇配制）中，常温下浸泡12h。经乙 醇、去离子水清洗和氮气干燥后，浸入0.6M的环氧氯丙烷溶液（二乙二醇二甲醚配制）中， 常温下浸泡4h。用去离子水清洗及氮气吹干后浸入浓度为lmg/mL、分子量lOkDa透明质酸 溶液（〇. 1M氢氧化钠溶液配制）中，常温下浸泡16h。用去离子水清洗并用氮气吹干。然后 浸入1M的溴乙酸溶液（1M氢氧化钠溶液配制）中，常温下浸泡12h。用去离子水清洗并用 氮气吹干。得到如图6所示的基于透明质酸生物传感芯片，其中巯基醇层为单分子层，透明 质酸层6-10纳米。
[0034] 实施例2
[0035] 通过真空溅射在BK7玻璃基底上先涂覆一层2nm厚铬层，再涂覆一层48nm厚金膜 或者金银合金（任意混合比例），获得了裸金芯片。将裸金芯片浸入浓硫酸与双氧水（体积 比1:0. 6)混合溶液中，常温下浸泡3h。然后取出用去离子水清洗再用氮气吹干。将干燥后 的裸金芯片浸入5mM的11-巯基-1- i^一醇溶液（乙醇配制）中，常温下浸泡12h。经乙 醇、去离子水清洗和氮气干燥后，浸入0.6M的环氧氯丙烷溶液（二乙二醇二甲醚配制）中， 常温下浸泡4h。用去离子水清洗及氮气吹干后浸入浓度为3mg/mL、分子量lOOOkDa透明质 酸溶液（〇. 1M氢氧化钠溶液配制）中，常温下浸泡16h。用去离子水清洗并用氮气吹干。然 后浸入1M的溴乙酸溶液（1M氢氧化钠溶液配制）中，常温下浸泡12h。用去离子水清洗并 用氮气吹干。得到如图1所示的基于透明质酸生物传感芯片，其中巯基醇层为单分子层，透 明质酸层8-12纳米。
[0036] 实施例3
[0037] 通过真空溅射在BK7玻璃基底上先涂覆一层2nm厚铬层，再涂覆一层48nm厚金膜 或者金银合金（任意混合比例），获得了裸金芯片。将裸金芯片浸入浓硫酸与双氧水（体积 比1:1)混合溶液中，常温下浸泡3h。然后取出用去离子水清洗再用氮气吹干。将干燥后的 裸金芯片浸入5mM的11-巯基-1- i^一醇溶液（乙醇配制）中，常温下浸泡12h。经乙醇、 去离子水清洗和氮气干燥后，浸入0.6M的环氧氯丙烷溶液（二乙二醇二甲醚配制）中，常 温下浸泡4h。用去离子水清洗及氮气吹干后浸入浓度为10mg/mL、分子量2000kDa透明质 酸溶液（〇. 1M氢氧化钠溶液配制）中，常温下浸泡16h。用去离子水清洗并用氮气吹干。然 后浸入1M的溴乙酸溶液（1M氢氧化钠溶液配制）中，常温下浸泡12h。用去离子水清洗并 用氮气吹干。得到如图1所示的基于透明质酸生物传感芯片，其中巯基醇层为单分子层，透 明质酸层10-15纳米。
[0038] 实施例4
[0039] 将实施例2获得的透明质酸基SPR芯片用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以 pH为7. 3的磷酸缓冲液为流动相，流速为10 μ L/min。待基线平稳后，往定量环中注入 100 μ Llmg/mL的牛血清白蛋白溶液，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测 定共振角实时变化曲线，20min后读取SPR共振角变化值，并计算非特异性吸附量为8. Ong/ cm2。
[0040] 实施例5
[0041] 将实施例2获得的透明质酸基SPR芯片用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH 为7. 3的磷酸缓冲液为流动相，流速为10 μ L/min。待基线平稳后，往定量环中注入100 μ L 溶菌酶（lmg/mL)或牛血清蛋白（lmg/mL)或豆楽（10mg/mL)或牛奶（30mg/mL)或橙汁 (10mg/mL)溶液，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲 线，20min后读取SPR共振角变化值，并计算非特异性吸附量分别为4. 6ng/cm2、7. 7ng/cm2、 0· 6ng/cm2、9. 8ng/cm2 和 16. lng/cm2。
[0042] 实施例6
[0043] 将实施例2获得的透明质酸基SPR芯片用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以 pH为7. 3的磷酸缓冲液为流动相，流速为10 μ L/min。待基线平稳后，往定量环中内注入 10(^1^1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺出0(：，浓度为0.41)和^羟基硫代 琥珀酰亚胺（NHSS，浓度为0. 1M)的混合溶液，经流动相推动EDC/NHSS溶液到达芯片表面。 15min后注入100 μ L牛血清蛋白抗体（anti-BSA，lmg/mL)，经流动相推动anti-BSA溶液到 达芯片表面，经过乙醇胺封闭后，30min后获得固载anti-BSA的SPR传感芯片。
[0044] 将上述获得的透明质酸基SPR芯片用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH为7. 3 的磷酸缓冲液为流动相，流速为10 μ L/min。待基线平稳后，往定量环中注入100 μ L溶菌酶 (lmg/mL)或豆浆（10mg/mL)或牛奶（30mg/mL)或10%血清或100%血清，经流动相推动蛋 白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取SPR共振角变化 值，并计算非特异性吸附量分别为 〇· 67ng/cm2、2. 5ng/cm2、17ng/cm2、16ng/cm2 和 60ng/cm2。
[0045] 实施例7
[0046] 将实施例1获得的透明质酸基SPR芯片用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以 pH为7. 3的磷酸缓冲液为流动相，流速为10mL/min。待基线平稳后，往定量环中内注入 10(^1^1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺出0(：，浓度为0.41)和^羟基硫代 琥珀酰亚胺（NHSS，浓度为0. 1M)的混合溶液，经流动相推动EDC/NHSS溶液到达芯片表 面。15min后注入100 μ L牛血清蛋白抗体（anti-BSA, lmg/mL),经流动相推动anti-BSA 溶液到达芯片表面，经过乙醇胺封闭后30min后获得固载anti-BSA的SPR传感芯片，分 别注入l〇〇yL溶菌酶（lmg/mL)、豆浆（10mg/mL)、不同浓度的牛血清蛋白（15nM、75nM、 150nM、300nM、450nM和700nM)、牛血清蛋白+溶菌酶（15nM, lmg/mL)、牛血清蛋白+豆浆 (15nM，10mg/mL)，由SPR系统记录共振角实时变化的BSA溶液，记录共振角变化，获得BSA 含量和检测标准曲线。
[0047] 本发明基于透明质酸修饰的表面等离子共振仪芯片及其制备方法。透明质酸修饰 芯片的结构依次为玻璃层、铬层、金膜层、巯基醇单分子层和透明质酸层组成。在金膜表面 上用巯基十一醇修饰，形成自组装单层。然后经环氧氯丙烷环氧化之后浸入透明质酸溶液 中，共价修饰一层透明质酸，进而采用溴乙酸进行羧基化，获得一种基于透明质酸的表面等 离子共振仪芯片。本发明的芯片在单一蛋白（牛血清蛋白、溶菌酶），天然复杂样品（牛奶、 豆浆、橙汁）以及10%的血清中均具有优良的抗污染性能，并且对生物大分子抗体具有高 固载量和良好的相容性，可实现复杂蛋白体系（溶菌酶、豆浆）中目标分子的高特异性、灵 敏快速检测。本发明的芯片具有优良的抗污染性能、高稳定性和高固载量等优点，且原料成 本低、制备方法易于操作，有很好的经济可行性和实用性。
【权利要求】
1. 一种基于透明质酸的表面等离子共振仪芯片；其特征是透明质酸修饰芯片的结构 依次为玻璃层、铬层、金膜层、巯基醇单分子层和透明质酸层组成。
2. 如权利要求1所述的共振仪芯片；其特征是所述BK7玻璃层厚度为0. 3-0. 7毫米。
3. 如权利要求1所述的共振仪芯片；其特征是所述铬层厚度为2-3纳米。
4. 如权利要求1所述的共振仪芯片；其特征是所述金膜层厚度为45-50纳米。
5. 如权利要求1所述的共振仪芯片；其特征是所述巯基醇层为单分子层。
6. 如权利要求1所述的共振仪芯片；其特征是所述透明质酸层厚度为6-15纳米。
7. 权利要求1的基于透明质酸的表面等离子共振仪芯片制备方法，其特征在于包括以 下步骤： a) 裸金芯片制备 通过真空溅射在BK7玻璃基底上先涂覆2-3nm厚铬层，再涂覆45-50nm厚金膜，获得了 裸金芯片； b) 裸金芯片预处理 将步骤a)获得的裸金芯片浸入浓硫酸与双氧水体积比1:0. 4-1:1的混合溶液中，常温 下浸泡l-6h ;然后取出用去离子水清洗直至表面无硫酸及双氧水残留，再用氮气吹干； c) 巯基醇修饰 用无水乙醇配制浓度为5-10mM的11-巯基-1-十一醇溶液；将步骤b)获得的裸金芯 片浸入上述11-巯基-1-十一醇溶液中，常温下浸泡6-15h后取出，在金膜表面形成了巯基 醇自组装单层；用乙醇和去离子水清洗直至未结合到金膜表面巯基醇被清洗干净，再用氮 气吹干； d) 透明质酸修饰 1) 用二乙二醇二甲醚配制浓度为0. 6M的环氧氯丙烷溶液；将步骤c)获得的芯片浸入 上述环氧氯丙烷溶液中，常温下浸泡2-8h后取出；用去离子水清洗掉残留的环氧氯丙烷及 二乙二醇二甲醚，再并用氮气吹干； 2) 用0. 1M的氢氧化钠溶液配制浓度为1-lOmg/mL、分子量为10-2000kDa的透明质酸 溶液；将步骤1)获得的芯片浸入上述透明质酸溶液中，常温下浸泡5-24h后取出；用去离 子水洗掉未反应的透明质酸，并用氮气吹干备用； e) 羧基化改性 用1M的氢氧化钠溶液配制浓度为1M的溴乙酸溶液；将步骤d)获得的芯片浸入上述溴 乙酸溶液中，常温下浸泡8-24h，在自组装单层表面修饰了一层透明质酸层。用去离子水清 洗并用氮气吹干。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征是所述的金膜用银膜、银/金复合膜替换。
9. 如权利要求7所述的方法，其特征是所述的透明质酸分子量为10-2000kDa，浓度为 1 -10mg/mT,n
【文档编号】G01N33/68GK104155453SQ201410330967
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】苏荣欣, 黄仁亮, 刘霞, 齐崴, 何志敏 申请人:天津大学