一种表面等离子共振传感器及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测miRNA-21的表面等离子共振传感器，包括工作芯片，所述工作芯片为在裸金芯片上固定针对miRNA-21的捕获探针所得。应用本发明的传感器对miRNA-21进行检测，校准曲线做四参数拟合，回归方程为Y = (A1 - A2)/(1 + (X/X0)^P) + A2，A1 =-69.95 ± 7.34，A2 = 2890.50 ± 18.50，X0 = 5.27 ± 0.16，P = 0.47 ± 0.01，检测范围为0.01-1000 nM，相关系数为0.9978，最低检测限为0.009 nM。与现有技术比较，所述传感器无酶、免标记，能实时监测，并且灵敏度高、特异性好、成本低、操作简便，检测周期短，适用于实际样品的测定等，有望成为具有实际应用价值的传感器。
【专利说明】一种表面等离子共振传感器及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物传感器领域，尤其涉及一种用于检测MiRNA-21的表面等离子共 振传感器及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一类近年来发现的、高度保守的短链非编码小分子（18? 25nt)单链RNA，研宄发现其在细胞生长和发育过程中起多种调控作用，已成为肿瘤生物学 研宄的热点领域。miRNA在血浆和血清中非常稳定，能抵抗RNA裂解酶（RNases)的降解，在 严酷环境下，其含量仍能保持相对稳定。因此，miRNA具有作为理想的生物标志物所需的一 些特性，为其作为生物标志物用于临床诊断提供了可能。
[0003] 传统的miRNA检测方法主要有Northern印迹、微阵列杂交、RT-PCR等，但各种方 法互有优劣，目前尚缺乏简便、快速、高灵敏、高特异的检测方法。Northern印迹是最早用于 各种miRNA分析的技术，被认为是miRNA研宄分析的金标准，该方法由于检测步骤复杂、耗 时长、通量低、灵敏度低且需对大量的样品进行检测，不适于对日常miRNA进行分析。微阵 列技术具有高通量检测能力并能对多种miRNAs进行分析，然而序列短及同源miRNA具有交 叉杂交的可能性，导致该方法的灵敏度及特异性均降低，因而只适于一般的筛查分析，而不 适于精确定量分析。qRT-PCR的方法因其高度的特异性和灵敏度而被广泛用于miRNAs的检 测，但操作过程需要逆转录步骤和温度循环，且需设计引物及昂贵仪器，从而限制了该方法 的使用。因此，为适应临床诊断治疗，特别是个体化诊断治疗的需求，发展快速、简便、高灵 敏、高特异的可用于细胞、血液、体液及组织中miRNA检测的分析方法是当今生物传感研宄 领域一项亟待解决的课题，也是近年来研宄热点之一。
[0004] 表面等离子共振（SPR)生物传感器为近年来发展起来的光学传感技术，其原理为 在传感芯片表面，当待测分子与配体结合时，会引起芯片表面介质的折射率发生改变，其变 化与结合分子的量有关，SPR通过监测折射率的变化而达到检测某待测物质含量的目的。 SPR生物传感器具备实时、快速、免标记、重现性好、灵敏度高、样品无需纯化等优点，是一种 强有力的生物分子分析工具，已应用于蛋白质、核酸，以及小分子的检测分析。因此应用SPR 传感器检测样品中miRNA具有非常重要的意义。但针对生物样品中miRNA的SPR传感器研 宄与应用尚不成熟。
[0005] 为了弥补现有miRNA检测技术的不足，旨在建立一种新型表面等离子共振传感器 用于miRNA的快速、灵敏检测。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一方面提供一种检测miRNA-21的表 面等离子共振传感器，包括用于检测miRNA-21工作芯片，所述工作芯片为在裸金芯片表面 固定针对miRNA-21的捕获探针所得。
[0007] 优选地，所述捕获探针为茎环结构，包含一段与miRNA-21完全互补的碱基序列， 所述捕获探针的序列如SEQIDNO. 1?3所示，具体为：
【权利要求】
1. 一种检测miRNA-21的表面等离子共振传感器，包括用于检测miRNA-21工作芯片，所 述工作芯片为在裸金芯片表面固定针对miRNA-21的捕获探针所得。
2. 根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述捕获探针为茎环结构，包含一段与 miRNA-21完全互补的碱基序列，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO. 1?3所示。
3. 根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，每个工作芯片上，含有所述捕获探针的 摩尔量为 3. 5xlCT2?14x10 -2nmol。
4. 一种如权利要求1?3任一权利要求所述表面等离子共振传感器中的工作芯片的制 备方法，所述方法为先在裸金芯片表面固定针对miRNA-21的捕获探针，而后进行封闭芯片 所得。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤： (1) 裸金芯片表面处理：将裸金芯片表面进行处理，使其表面光洁； (2) 固定针对miRNA-21的捕获探针：将捕获探针溶于探针固定溶液配置捕获探针溶 液，然后将捕获探针溶液流过处理干净的裸金芯片表面； (3) 封闭芯片：封闭非特异性吸附位点，即得工作芯片。
6. -种用于检测miRNA-21的检测系统，包括如权利要求1?3任一权利要求所述表面 等离子共振传感器。
7. 根据权利要求6所述的检测系统，其特征在于，所述检测系统还包括辅助DNA探针 1、辅助DNA探针2和链霉亲和素，所述辅助DNA探针1的序列如SEQ ID NO. 4?6所示，所 述辅助DNA探针2的序列如SEQ ID NO. 7?9所示。
8. 根据权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述辅助DNA探针1和辅助DNA探针 2的摩尔比为3:1?1:3。
9. 根据权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述辅助DNA探针1和辅助DNA探针 2的摩尔浓度分别为250nM?2000nM。
10. 根据权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述链霉亲和素的摩尔浓度为 100nM ?300nM。
【文档编号】G01N21/552GK104458659SQ201410762442
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】丁世家, 丁小娟, 颜玉蓉, 程伟, 袁泰先, 李胜强, 张晔, 李丹丹 申请人:重庆医科大学