一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法。
【背景技术】
[0002]FA0/WH0认定的导致人类食物过敏的八大类食品中，牛乳及其制品就是其中之一。在欧美的食品标签法中也规定了牛乳是必须标示的食物过敏原成分。乳球蛋白(β-lactoglobulin，0LG)是牛乳中的主要过敏原，牛乳过敏原0LG的检测方法目前主要是针对牛乳中特异性过敏原蛋白质或编码过敏原的DNA片段。以DNA片段为检测目标的检测的手段，依赖聚合酶链式反应(PCR)来扩增特定的DNA片段，检测食品中过敏原基因的DNA残留，这种技术是把编码过敏原蛋白的DNA作为食物过敏物质的检测目标而不是检测过敏原蛋白本身。这类方法目前应用比较广泛是定性PCR和实时荧光定量PCR (Real-time PCR)o Real-time PCR可以利用特异性探针提高检测的特异性。目前，PCR技术已用于不同食品过敏原的检测。但食物过敏反应主要是由于食物中过敏原蛋白所引起，并不是蛋白对应的基因本身，PCR出现阳性结果也不能说明食物中含有对应的过敏原蛋白。因此，以检测过敏原基因为基础的方法并不是理想的检测方法，在实际检测中应用较少。
[0003]检测食物中特异性过敏原蛋白质的方法主要是基于蛋白与特异抗体的免疫反应性。制备高效价的特异性抗体是过敏原蛋白检测的关键。在牛乳过敏原的免疫检测中就是利用抗原和抗体的特异结合的原理。目前，最主要的免疫检测方法就是ELISA法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。有两种半定量的 ELISA 方法:分别是双抗体夹心法(Double antibody sandwich method ELISA，S-ELISA)和竞争法(CompetitiveELISA, C-ELISA)，其中双抗体夹心法灵敏高也最为常用。ELISA的蛋白检测方法主要是检测食品中的牛乳总蛋白或牛乳主要过敏原(β LG, CNs, BSA), S-ELISA的检出限(LOD) —般是约为2.5ppm，C-ELISA的LOD —般约为lppm。纯化的抗β LG多克隆抗体已经用于双抗体夹心法检测婴幼儿奶粉和人乳中低剂量的^!^，其检出限可达到。.。。]!^.!^-1。目前，基于抗β LG单克隆抗体的双抗体夹心法也用于检测天然或变性的β LG,可检测热处理后变性的牛乳及其制品。抗酪蛋白多克隆抗体和单克隆抗体也已用于牛乳中酪蛋白的检测，主要用于评价水解婴幼儿奶粉蛋白的免疫反应性。ELISA的检测所用时间大约4h，对人员的操作要求也较高。
[0004]除了 ELISA方法外，电泳法(SDS-PAGE)、质谱法(LC/MS/MS)，免疫印迹法(WesternBlotting)也用于水解牛乳中牛乳过敏原的检测。但与传统的ELISA方法相比，这些方法的灵敏度不高，对低剂量的过敏原检测不出或成本太高。
【发明内容】
[0005]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，旨在解决现有检测方法存在的耗时耗力，灵敏度不高及对低剂量的过敏原检测不出或成本太高的问题。
[0006]本发明的技术方案如下:
一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，包括步骤:
A、以牛乳乳球蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗牛乳乳球蛋白多克隆抗体；
B、以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗牛乳乳球蛋白单克隆抗体；
C、通过偶联的方法将抗牛乳乳球蛋白单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的牛乳乳球蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗牛乳乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号，得到检测结果。
[0007]所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤A具体包括:以牛乳β -乳球蛋白作为抗原，将牛乳β -乳球蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将牛乳β -乳球蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后夹动物眼球取血，离心取血清，制得抗牛乳乳球蛋白多克隆抗体。
[0008]所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤A之后还包括:对抗牛乳β -乳球蛋白多克隆抗体进行效价测定、纯化及特异性测定。
[0009]所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B具体包括:以牛乳β -乳球蛋白作为抗原，将牛乳β -乳球蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将牛乳β -乳球蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后取免疫后的动物脾细胞与骨髓瘤细胞混合，通过PEG法进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行筛选与克隆，制得抗牛乳乳球蛋白单克隆抗体。
[0010]所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B还包括对抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体进行纯化处理，所述纯化处理具体包括:用牛乳乳球蛋白为靶抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应，取阳性杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成I X 106/mL，接种动物腹腔每只0.5mL，待8?1d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，纯化腹水，得到一株抗牛乳β -乳球蛋白单克隆抗体。
[0011]所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B还包括采用免疫印迹法对抗牛乳β -乳球蛋白单克隆抗体进行鉴定，并采用不同的抗IgG类型单抗对抗牛乳乳球蛋白单克隆抗体进行抗体类型测定。
[0012]所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B还包括对抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体进行特异性测定。
[0013]所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤D具体包括步骤:
D1、将抗牛乳乳球蛋白单克隆抗体固定于检测芯片上；
D2、以3?7 μ L/min的流速注射一浓度的牛乳β -乳球蛋白流经检测芯片280~320s ； D3、以3~7 μ L/min的流速注射HBS-EP缓冲液平衡检测芯片表面150~200s ；
D4、以3~7 μ L/min的流速注射抗牛乳β _乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号；
D5、以 25~35yL/min 的流速注射 8~10mM Glycine-HCl 25~35s，3 次用于抗牛乳 β-乳球蛋白单克隆抗体的表面；
在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代一定浓度的牛乳β -乳球蛋白作为样本零浓度用来检测LOD。
[0014]所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤Dl中，所述抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的固定具体包括步骤:
Dl1、注射HBS-EP缓冲液，以8~12 μ L/min的流速平衡检测芯片表面4~7min ；
D12、注射NHS与EDC的混合液，以8~12 μ L/min的流速活化检测芯片表面5~10min ；D13、注射抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体，以8~12yL/min的流速偶联检测芯片5~10min ；
D14、注射乙醇胺，以8~12 μ L/min的流速封闭检测芯片表面5~10 min。
[0015]所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤D2中，用HBS-EP缓冲液将牛乳 β -乳球蛋白稀释为 5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL的不同浓度的牛乳乳球蛋白。
[0016]有益效果:本发明利用抗牛乳乳球蛋白单克隆抗体作为固定抗体，捕抓牛乳β -乳球蛋白，再通过抗牛乳β -乳球蛋白多克隆