一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种封闭液及其应用，尤其涉及一种减少体外检测中生物样本假阳性 的封闭液及其应用，属于医学检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 免疫荧光层析检测系统是：聚苯乙烯荧光微球与抗体交联得到的抗体微球，与生 物样本（血清、血浆、全血）混合，混合液跑包被了抗体的试纸条，通过抗原抗体免疫反应来 定量样本中的标记物的含量。但是，生物样本中的某些蛋白会非特异性吸附在微球或抗体 表面，使检测结果产生假阳性。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种能减少体外检测中 生物样本假阳性的封闭液。
[0004] 本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种减少体外检测中生物样本假阳性 的封闭液，包括试剂A和试剂B，试剂A为氨基酸溶液，试剂B为3-琉基丙酸溶液。
[0005] 在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液中，试剂A和试剂B使用 时的浓度比为I :(0.5-1. 5)。
[0006] 带有极性或具有短侧链的离子型氨基酸单层分布在免疫荧光层析检测系统中的 抗体微球表面，能减少血清蛋白的非特异性吸附作用，减少血清的基底效应。从而减少体外 检测中生物样本假阳性的发生，提高检测的准确度。
[0007] 因此，本发明免疫荧光层析检测系统中荧光微球在交联上抗体得到抗体微球后， 用本发明包含试剂A和试剂B的封闭液进行封闭处理，一方面可以封闭微球上未交联上抗 体的结合位点，另一方面可以形成N-3-巯基丙基-氨基酸极性氨基酸单层，排布在微球表 面，形成一个表面浓度大约1015个分子/cm 2的球体，可以有效的减少样本中蛋白分子的非 特异性吸附，减少血清的基底效应。从而减少体外检测中生物样本假阳性的发生，提高检测 的准确度。
[0008] 但是，本发明封闭液使用前试剂A和试剂B需要分开储存，使用时再与抗体微球混 匀，否则，会由于反应产生副产物而导致封闭不能有效进行。
[0009] 本发明中，氨基酸与3-琉基丙酸的反应式如下：
[0010]
[0011] 在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液中，氨基酸为甘氨酸、谷 氨酸、精氨酸、赖氨酸中的一种。根据反应机理，氨基酸与3-巯基丙酸反应生成的短侧链 单层结构，需要参与反应的氨基酸有以下几个特点：1、氨基酸R基不能过于繁琐，尽量简 单，这样的氨基酸在反应时空间位阻会比较小；2、氨基酸所带的氨基（-NH2)数量多，便于与 3_巯基丙酸的羧基（-COOH)反应，形成的膜结构会更稳定；3、氨基酸的等电点处于中性偏 碱，这样的氨基酸在缓冲液中所带的电性更有利于极性短侧链氨基酸膜的形成。因此，本发 明进一步优选为赖氨酸。
[0012] 本发明的另一个目的在于提供上述一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭 液的应用，封闭液用于免疫荧光层析检测系统中的抗体微球的封闭。
[0013] 在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，具体应用过程 为：将荧光微球进行预处理，然后与抗体交联得到抗体微球，抗体微球再使用封闭液封闭， 最后用缓冲液保存。
[0014] 在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，荧光微球由粒 径为450-600nm的荧光微球I和粒径为100-300nm的荧光微球II组成，粒径为450-600nm 的荧光微球I和粒径为100_300nm的荧光微球II的质量比为1 : (0. 5-1. 5)。本发明荧光微 球的选择对免疫荧光层析检测系统的检测性能的影响重大。因为，粒径小的荧光微球内包 含的荧光物质少，同摩尔浓度下荧光信号少，但是它的线性范围宽，比例好；而粒径大的荧 光微球每个微球中包含的荧光物质多，能显著提升试剂盒的灵敏度，在抗原含量少的项目 中，这一特性必不可少。因此，本发明中选取的荧光微球是大小不同的粒径的荧光微球组成 的混合微球，混匀后，再进行交联。从而可以提高检测的灵敏度，同时也可以拉宽检测线性。
[0015] 作为优选，预处理包括清洗和活化。由于荧光微球为一种悬浊液，需要先进行清洗 去除杂质。
[0016] 作为优选，封闭后还需要进行清洗。抗体微球使用封闭液封闭后，进行清洗，可以 获得更好的检测效果。清洗液的成分为以5-20mM的PBS为母液，添加0. 03-0.1 wt %的TW20 配制得到，清洗液的PH为7-8。
[0017] 在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，缓冲液的成分 为：Tris :20-100mM，酪蛋白：0· 5-2wt %，BSA :0· 3-lwt %，表面活性剂：0· 3-lwt %，金属螯 合剂：3-20mM，PEG :0· 5-5wt%，NaN3:0. 05-0. 3wt%。本发明缓冲液是以 20-100mM 的 Tris 为母液，向其中添加酪蛋白，BSA，表面活性剂，金属螯合剂，PEG和NaN3配制而成。
[0018] 在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，缓冲液的pH 为 8-10〇
[0019] 在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，表面活性剂为 TritonX-100、TW20、BRIJ35、Tetronicl307、BIO-TERGE AS-40 中的一种。
[0020] 在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，金属螯合剂为 EDTA-Na、DEG、HEDTA 中的一种。
[0021] 封闭清洗后用本发明缓冲液保存抗体微球，本发明缓冲液pH高，抗体微球处于此 环境中会带负电荷，有利于封闭的稳定性。其次，若长期保存后抗体微球上未与抗体结合的 位点又暴露出来，本发明缓冲溶液中的酪蛋白和BSA能及时覆盖住这些位点，保证了交联 微球的特性。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下几个优点：
[0023] 1.本发明封闭液中两种试剂反应后得到的离子型氨基酸单层分布在免疫荧光层 析检测系统中的抗体微球表面，能减少血清蛋白的非特异性吸附作用，减少血清的基底效 应，从而减少体外检测中生物样本假阳性的发生，提高检测的准确度。
[0024] 2.本发明免疫荧光层析检测系统的检测灵敏度高，检测线性宽。
[0025] 3.本发明免疫荧光层析检测系统的稳定性强。
【附图说明】
[0026] 图1为应用实施例1和应用对比例1两种封闭方法交联荧光微球的校准曲线；
[0027] 图2为应用实施例1和梅里埃VIDAS测血清PCT浓度的相关性曲线。
【具体实施方式】
[0028] 以下是本发明的具体实施例，并结合【附图说明】对本发明的技术方案作进一步的描 述，但本发明并不限于这些实施例。
[0029] 实施例1 :
[0030] 本实施例封闭液包括试剂A和试剂B，试剂A为赖基酸，试剂B为3-琉基丙酸，分开 储存，使用时，将试剂A和试剂B与抗体微球混合。其中，试剂A和试剂B的浓度比为1:1。
[0031] 实施例2:
[0032] 本实施例封闭液包括试剂A和试剂B，试剂A为甘氨酸，试剂B为3-琉基丙酸，分开 储存，使用时，将试剂A和试剂B与抗体微球混合。其中，试剂A和试剂B的浓度比为1:1。
[0033] 实施例3 :
[0034] 本实施例封闭液包括试剂A和试剂B，试剂A为谷氨酸，试剂B为3-琉基丙酸，分开 储存，使用时，将试剂A和试剂B与抗体微球混合。其中，试剂A和试剂B的浓度比为1:1。
[0035] 实施例4 :
[0036] 本实施例封闭液包括试剂A和试剂B，试剂A为精氨酸，试剂B为3-琉基丙酸，分开 储存，使用时，将试剂A和试剂B与抗体微球混合。其中，试剂A和试剂B的浓度比为1:1。
[0037] 在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的实施方案及其替换方案中，试 剂A和试剂B 的浓度比还可以为 1 :0·5、1 :0·6、1 :0·7、1 :0·8、1 :0·9、1 :1· 1、1 :1.2、1 :1.3、 I :1. 4、1 :1· 5〇
[0038] 将本发明的能减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液用于免疫荧光层析检测 系统中的抗体微球的封闭。
[0039] 应用实施例1 :
[0040] 以免疫荧光层析检测系统中的PCT免疫荧光层析快速诊断试剂项目和本发明实 施例1中的封闭液为例：
[0041 ] 取3mg荧光微球，荧光微球由500nm的荧光微球I和200nm的荧光微球II按质量 比为1:1混合而成，先将荧光微球在ll°C、15000r离心10min，然后加 ImL浓度为IOmM的 MES在15000r离心20min。再用ImL浓度为IOmM的MES溶荧光微球，超声处理2min后 15000r离心25min，重复用ImL浓度为IOmM的MES溶荧光微球，超声处理2min后15000r 离心25min，取出清洗后的荧光微球。
[0042] 将上述取出的荧光微球进行活化处理，先加入276 μ L的MES，超声处理6min，然 后加入30uL浓度为50mg/mL EDC和30uL浓度为50mg/mL的NHS，混合均勾，在室温下振荡 30min〇
[0043] 将上述活化处理后的荧光微球先在15000r离心60min，再用ImL的pH为7· 4的 PBS清洗，清洗条件为15000r离心40min。再用500 μ L的pH为7. 4的PBS超声处理6min。 然后再加入500ug的PCT IgG (IgG用pH为7. 4的PBS溶解）混合均匀，使溶液铺满管壁， 之后在室温避光条件下振荡12h。
[0044] 将上述振荡液先15000r离心30min，再添加封闭液重悬，500uL封闭液试剂A (以 pH为7. 4的PBS溶解的IOOmM赖氨酸）与500uL封闭液试剂B (以pH为7. 4的PBS溶解的 IOOmM 3-琉基丙酸）充分混合，50°C振荡3h，然后15000r离心30min。之后用pH为7. 4的 由IOmM的PBS和0. 05wt%的TW20组成的PBST清洗三次，其中，清洗的后两次先用超声处 理 2min。
[0045] 最后，用pH为9的50mM的Tris缓冲液保存。其中，50mM的Tris缓冲液中含有： 酪蛋白：Iwt %，BSA :0· 5wt %，TW20 :0· 5wt %，EDTA-Na : 10mM，PEG : Iwt %，NaN3:0.1 wt %。
[0046] 应用对比例I :
[0047] 对比例1与实施例1的区别仅在于，对比例1的封闭液为1 %的BSA溶液（以pH 为7. 4的PBS溶解）。
[0048] 把相应的PCT抗体包被在NC膜上，NC膜的一端贴上吸水纸，另一端固定上样品垫， 这三部分组装成层析试纸条。将应用实施例1和应用对比例1交联后的荧光粒子稀释到 25ug/ml的浓度，与样品体积比1:1混合，混合液跑试纸条，试纸条孵育15min后，于焚光免 疫试条定量检测仪上读取荧光信号。
[0049] 取100ng/ml的PCT标准品，梯度稀释成不同浓度值，不同浓度的PCT标准品与交 联后的荧光粒子混合，混合浓度为25ug/ml，与样品体积比为1: 1，混匀后滴加到样品垫上， 跑层析试纸条，15min后，读取荧光信号值。应用实施例1和应用对比例1交联的粒子拉PCT 的标准曲线，结果如表1和表2所示。
[0050] 表1 :应用实施例1赖氨酸和3-琉基丙酸封闭后PCT校准曲线
[0051]
[0052] 表2 :应用对比例IBSA封闭后PCT校准曲线