本发明涉及体外诊断试剂技术领域，特别涉及一种胱抑素c的检测试剂及方法。
背景技术：
胱抑素c是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，分子量为13.3kd，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素c仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾小球滤过决定，而不依赖任何外来因素，如性别、年龄、饮食的影响，是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。它是新近发展起来的评估肾功能的一种敏感性好、特异性高的指标。
目前，胱抑素c的检测方法有：放射免疫法、elisa法、免疫荧光法和胶乳免疫比浊法等，其中放射免疫法因其存在放射性污染，操作复杂，检测时间长已渐被市场淘汰；酶联免疫法受人为因素影响较大，且不适合急诊样本的检测；免疫荧光法灵敏度好，特异性强，结果快速、准确，但此方法需要昂贵的仪器，测定成本高，临床难以普及。其中免疫比浊法，快速简便、精密度高、易于自动化、适于大批量标本的同时检测，便于推广，适合临床检测。但需要的抗体用量大，对抗体要求高(应具有高特异性、高滴度和高亲和力)，颗粒大小不同的胱抑素c会产生不一致的光散射与光吸收，而且受标本中的基质的影响较明显，容易受到类风湿因子的干扰，所以研发一种成本低、特异性好、偏差小的检测方法是目前的市场需求。
公开号为cn104360081a中公开了一种胱抑素c的检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，试剂r1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、edta、增凝剂和保护剂1组成，试剂r2主要由交联胱抑素c抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成。但实施例中公开的试剂盒在抗干扰能力方面还存在一定的欠缺。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种胱抑素c的检测试剂及方法。该检测试剂抗干扰能力强、特异性高、准确度高、稳定性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种胱抑素c的检测试剂，检测试剂由试剂1和试剂2组成；
试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、peg6000、防腐剂和水；
试剂2包括包被有胱抑素c单克隆抗体的胶乳微球、tris-hcl缓冲液、蔗糖、明胶、np30、防腐剂和水。
作为优选，试剂1中各组分的含量为：
氯化铵：0.2～1.0mmol/l；
聚氧乙烯月桂醚：0.1～1.0wt％；
氯化钠：150mmol/l；
peg6000：2wt％；
防腐剂：0.01～0.05wt％；
试剂1的ph值为7～9。
优选地，试剂1中各组分的含量为：
氯化铵：0.2mmol/l；
聚氧乙烯月桂醚：0.3wt％；
氯化钠：150mmol/l；
peg6000：2wt％；
防腐剂：0.05wt％；
试剂1的ph值为7.5。
作为优选，试剂2中各组分的含量为：
包被有胱抑素c单克隆抗体的胶乳微球：0.05～0.2wt％；
tris-hcl缓冲液：20～80mmol/l；
蔗糖：1～5wt％；
明胶：0.2～0.8wt％；
np30：0.05～0.2wt％；
防腐剂：0.3wt％；
试剂2的ph值为6～8。
优选地，试剂2中各组分的含量为：
包被有胱抑素c单克隆抗体的胶乳微球：0.1wt％；
tris-hcl缓冲液：50mmol/l；
蔗糖：3wt％；
明胶：0.5wt％；
np30：0.1wt％；
防腐剂：0.3wt％；
试剂2的ph值为7。
作为优选，试剂1中防腐剂为叠氮钠。
作为优选，试剂2中防腐剂为proclin300。
在本发明提供的实施例中，包被有胱抑素c单克隆抗体的胶乳微球是由胱抑素c单克隆抗体和胶乳微球采用化学交联法得到。
作为优选，抗体包被胶乳的化学交联剂为乙二胺(eda)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)。
作为优选，抗体包被胶乳的封闭剂为甘氨酸缓冲液。
作为优选，甘氨酸缓冲液的质量浓度为1％～5％，ph值6.5～8.5。
作为优选，胱抑素c单克隆抗体为鼠抗人载胱抑素c单克隆抗体。
作为优选，胶乳微球为疏水微球，所述疏水微球为带磺酸基基团、羧基基团或醛基基团的一种或两种以上的胶乳微球。
作为优选，胶乳微球的平均粒径为80～120nm。
在本发明提供的实施例中，胶乳微球的平均粒径为99nm。
作为优选，胱抑素c单克隆抗体与胶乳微球的质量比为(0.1～1)：100。
本发明还一种检测胱抑素c含量的方法，包括：待测样本加入试剂1中，孵育5～10min；再加入试剂2，孵育5～10min，在550nm波长下测定吸光度，通过胱抑素c的标准曲线得到待测样本中胱抑素c的含量；
试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、peg6000、防腐剂和水；
试剂2包括包被有胱抑素c单克隆抗体的胶乳微球、tris-hcl缓冲液、蔗糖、明胶、np30、防腐剂和水。
作为优选，孵育的温度为37℃。
作为优选，孵育的时间为5分钟。
本发明提供了一种胱抑素c的检测试剂及方法。该检测试剂由试剂1和试剂2组成；试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、peg6000、防腐剂和水；试剂2包括包被有胱抑素c单克隆抗体的胶乳微球、tris-hcl缓冲液、蔗糖、明胶、np30、防腐剂和水。本发明至少具有如下优势之一：
(1)本发明试剂的操作过程简单，相较于传统双试剂胶乳免疫比浊法，工作试剂无需配制，可直接在各种自动分析仪上使用。
(2)采用化学偶联的方法在胶乳微球上包被抗体，试剂稳定性良好。
(3)类风湿因子、溶血、黄疸和脂浊样本对测定结果没有明显干扰。
(4)本发明试剂的检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，重复性好，线性范围宽，特异性好，稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用。可很大程度上降低医院检测人员的工作强度，提高其工作效率，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定人血清中胱抑素c的含量。
具体实施方式
本发明公开了一种胱抑素c的检测试剂及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
中英文对照：
brij-35：聚氧乙烯月桂醚；
peg：聚乙二醇；
np30：壬基酚聚氧乙烯(30)醚。
本发明提供的胱抑素c的检测试剂及方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
以下实施例中市售国产胱抑素c试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)的配方如下：
试剂1：50mmol/l含1.0％nan3的甘氨酸缓冲液
试剂2：抗人cys-c-igg的致敏乳胶颗粒悬液
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明检测胱抑素c的试剂及方法
本实施例检测胱抑素c的试剂包括：
试剂1：氯化铵0.2mol/l，叠氮钠0.05％，brij-350.3％，氯化钠150mmol/l，peg60002％，用氨水调ph值，ph7.5；
试剂2：抗体包被的胶乳微粒(0.1％浓度)，tris-hcl缓冲液50mmol/l，蔗糖3％，明胶0.5％，np300.1％，proclin3000.3％，ph7.0。
其中，抗体包被的胶乳微粒的制备方法为：
(1)取1ml(10mg/ml)洗涤处理后的乳胶颗粒，加入到50ml的乙二胺(eda，1mol/l，ph4.75)中，孵育90min。
(2)加入固体的edc至终浓度10mm，缓慢搅拌90min。
(3)用纯净水充分洗涤，最后一次重悬于ph7.5的磷酸盐buffer中。
(4)抗体浓度大约7.5mg/ml10％的乳胶颗粒(直径99nm)，加入到0.05mol/l磷酸盐，0.15mol/lnacl的缓冲液中(ph7.5)，反应6小时。
(5)加入终止液终止反应。终止液：甘氨酸1％，ph7.5，充分混匀2小时。
检测方法：由全自动生化分析仪加入3μl样本，180μl试剂1，37℃反应5分钟，再加入60μl试剂2，37℃反应5分钟，测定550nm的吸光度值，根据标准曲线计算样品中胱抑素c的百分含量。
实施例2：本发明试剂及方法的准确度分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪
检测样品：20名体检者血样；
对比方法试剂盒：市售国产胱抑素c试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)；
用实施例1的检测方法和对比方法分别测定20例样品，检测结果见表1。
表1分析结果
结果显示，根据检测结果计算出的r2值为0.988，大于0.95，表明本发明所述方法检测结果与对比试剂盒检测结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。
实施例3：本发明试剂及方法的精密度分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：任意一血清样品：
采用实施例1的检测方法和对比专利(cn201410735830.9-一种改良的胱抑素c检测试剂盒)实施例3的检测方法对同一待测样品重复检测10次，检测结果见表2。
表2检测样品胱抑素c浓度(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示，本发明标准差率为2.4％，小于标准要求的10％，小于对比专利方法的3.81％，表明本发明所述方法具有较高的精密度。
实施例4：本发明试剂及方法的线性分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：高胱抑素c血清样品(8mg/l)；
将胱抑素c血清样品稀释成6个不同的浓度，依次为0mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、2.0mg/l、4.0mg/l、8.0mg/l，采用实施例1的检测方法对上述样品的每个浓度进行2次检测，计算相关系数r值，其中，实施例1的检测结果见表3。
表3线性试验结果
结果显示，根据实施例1检测结果计算出的r值为0.9966，接近于1，表明本发明方法在0.0mg/l-8.0mg/l的范围内具有良好的线性度。
实施例5：本发明检测胱抑素c的试剂盒
本实施例检测胱抑素c的试剂包括：
试剂1：氯化铵0.5mol/l，叠氮钠0.03％，brij-350.1％，氯化钠150mmol/l，peg60002％，用氨水调ph值，ph7.0；
试剂2：抗体包被的胶乳微粒(0.05％浓度)，tris-hcl缓冲液80mmol/l，蔗糖1％，明胶0.8％，np300.05％，proclin3000.3％，ph6.0。
其中，抗体包被的胶乳微粒的制备方法为：
(1)取1ml(10mg/ml)洗涤处理后的乳胶颗粒，加入到50ml的乙二胺(eda，1mol/l，ph4.75)中，孵育90min。
(2)加入固体的edc至终浓度10mm，缓慢搅拌90min。
(3)用纯净水充分洗涤，最后一次重悬于ph7.5的磷酸盐buffer中。
(4)抗体浓度大约7.5mg/ml10％的乳胶颗粒(直径99nm)，加入到0.05mol/l磷酸盐，0.15mol/lnacl的缓冲液中(ph7.5)，反应6小时。
(5)加入终止液终止反应。终止液：甘氨酸1％，ph7.5，充分混匀2小时。
检测方法：由全自动生化分析仪加入3μl样本，180μl试剂1，37℃反应5分钟，再加入60μl试剂2，37℃反应5分钟，测定550nm的吸光度值，根据标准曲线计算样品中胱抑素c的百分含量。
实施例6：本发明检测胱抑素c的试剂盒
本实施例检测胱抑素c的试剂包括：
试剂1：氯化铵1.0mol/l，叠氮钠0.01％，brij-351.0％，氯化钠150mmol/l，peg60002％，用氨水调ph值，ph9；
试剂2：抗体包被的胶乳微粒(0.2％浓度)，tris-hcl缓冲液20mmol/l，蔗糖5％，明胶0.2％，np300.2％，proclin3000.3％，ph8.0。
其中，抗体包被的胶乳微粒的制备方法为：
(1)取1ml(10mg/ml)洗涤处理后的乳胶颗粒，加入到50ml的乙二胺(eda，1mol/l，ph4.75)中，孵育90min。
(2)加入固体的edc至终浓度10mm，缓慢搅拌90min。
(3)用纯净水充分洗涤，最后一次重悬于ph7.5的磷酸盐buffer中。
(4)抗体浓度大约7.5mg/ml10％的乳胶颗粒(直径99nm)，加入到0.05mol/l磷酸盐，0.15mol/lnacl的缓冲液中(ph7.5)，反应6小时。
(5)加入终止液终止反应。终止液：甘氨酸1％，ph7.5，充分混匀2小时。
检测方法：由全自动生化分析仪加入3μl样本，180μl试剂1，37℃反应5分钟，再加入60μl试剂2，37℃反应5分钟，测定550nm的吸光度值，根据标准曲线计算样品中胱抑素c的百分含量。
实施例7：本发明试剂的抗干扰性分析
在同一份血清样本中加入不同浓度的类风湿因子(50，150，250，500、800iu/ml)；血红蛋白(0，1.25，2.5，5，10g/l)；胆红素(0，128，256，512，1024μmol/l)；甘油三酯(0，10，20，40，80mmol/l)采用实施例1、5、6的检测方法和对比专利(cn201410735830.9-一种改良的胱抑素c检测试剂盒)实施例3的检测方法与未加入类风湿因子，血红蛋白，胆红素，甘油三酯的血清做对比，计算样品胱抑素c浓度的平均值和偏差，其检测结果见表4-7。
表4抗类风湿因子干扰实验结果
表5抗溶血干扰结果
表6抗黄疸干扰实验结果
表7抗黄疸干扰实验结果
结果显示，本发明实施例1、5、6的试剂类风湿因子≤800iu/ml，血红蛋白≤10g/l，胆红素≤1024μmol/l，甘油三酯≤80mmol/l对测值没有影响，而对比专利仅在类风湿因子<300iu/ml，血红蛋白≤5g/l，胆红素≤512μmol/l，甘油三酯≤80mmol/l对测值没有影响；可见本申请的抗干扰能力好于对比专利。
实施例8：本发明试剂的稳定性
取本发明实施例6的检测试剂和本发明实施例6配方中不添加蔗糖的试剂进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按实例6的检测方法，2，5，8，10，12个月进行检测，检测低值质控和中值质控的标准偏差，其检测结果见表8。
表8稳定性实验结果
结果显示，添加蔗糖的本发明试剂稳定性好于不添加蔗糖的本发明试剂，可见，蔗糖的添加起到了增强本发明试剂稳定性的效果。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。