专利名称：一种具有天然活性的重组人胱抑素c蛋白及其制备方法
—种具有天然活性的重组人胱抑素C蛋白及其制备方法技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种具有天然活性的重组人胱抑素C蛋白及其制备方法。
背景技术：
胱抑素C (Cystatin C，CysC)又称为半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，分子量为13kD， 含有120个氨基酸残基，是一种非糖基化的椭圆形小分子蛋白，其前体分子含有26个氨基酸的信号肽。其广泛存在于各种体液中如血液、脑脊液、唾液、精液、尿液等，以脑脊液中含量最高，尿液最低，并且所有的有核细胞都能稳定地产生胱抑素C。在生理条件下，胱抑素 C的重要功能是抑制内源性的半胱氨酸蛋白酶的活性。对于细胞内蛋白质的转换，骨胶原的降解，蛋白质前体的分离有重要作用。胱抑素C可参与肿瘤的侵袭和转移，参与炎症过程及一些神经性疾病。在这些疾病中，半胱氨酸蛋白酶与其抑制物是否处于平衡状态，一旦失衡，将造成一些病理损伤。
因胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由过滤，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C浓度主要由肾小球滤过率(GFR)决定，由此可见胱抑素C是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物。同时有研究报道 应用兔抗胱抑素C抗体建立的酶联免疫吸附(ELISA)技术检测了急性心肌梗塞病人急性期、恢复期及正常对照组血清胱抑素C水平，发现急性期与恢复期的自身对照并无显著性差异，但有意义的是这两者的胱抑素C水平均显著低于正常对照组。提示胱抑素C的血清浓度改变，在一定程度上可以作为急性心肌梗塞诊断参考指标。
急性肾功能衰竭(ARF)传统的诊断方法主要是根据血肌酐(SCr)水平，但SCr水平受多种因素的影响，不能精确反映GFR，特别是在轻中度肾功能损伤时。Villa等对50例重症监护病房(I⑶)患者进行研究，通过观察比较SCr、血清CysC和GFR，结果发现Cys C 与GFR相关性更好，在25例ARF患者中，19例血清Cys C浓度升高，而SCr升高仅5例，提示在诊断ARF方面Cys C可能比SCr更具价值。
血清胱抑素C浓度的测定具有重要的诊断意义，但目前我国还没有自主研发的胱抑素C诊断试剂。究其原因制备胱抑素C诊断试剂盒需要特异性强和灵敏度高的胱抑素C 单克隆抗体或多抗血清，而要得到该单克隆抗体或多抗血清就必须得到高纯度的胱抑素C 蛋白，传统的从胎盘、尿液等组织中提取的胱抑素C蛋白浓度低，纯度差，批间差大，无法用做免疫原制备单抗或多抗，即使用做免疫原制备用于免疫比浊等方法的诊断产品，也存在较严重的交叉问题，要提取高纯度的免疫原，纯化成本相当高。发明内容
本发明的目的是提供一种具有天然活性的重组胱抑素C蛋白及其制备方法。
为实现上述目的，本发明公开了一种得到具有天然活性的重组胱人抑素C蛋白的制备方法，该方法包括将人胱抑素C核酸序列与表达载体重组后转化表达宿主细胞,培养宿主细胞后收集纯化重组表达的人胱抑素C蛋白，再将该蛋白进行蛋白酶酶切处理。
上述蛋白酶可选自胰蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、内肽酶Lys-C、Xa因子、内肽酶 Arg-C中的任一种。
所述蛋白酶包括天然提取及其基因工程重组蛋白酶。
所述蛋白酶酶切中重组人胱抑素C蛋白与蛋白酶质量比为50 I 1000 I。
所述酶切处理的条件为30 37°C切割5-30分钟，或3 5°C条件下作用20-28 小时。
本发明中优选蛋白酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶包括天然提取和基因工程重组的胰蛋白酶，可优选用重组人胰蛋白酶。
本发明中优选的，所述重组人胱抑素C蛋白具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列。
本发明中的一个实施例公开的所述重组人胱抑素C蛋白可由SEQ ID N0:1所示核酸序列编码表达。
上述表达载体为原核表达载体，且该原核表达载体的融合蛋白标签可利用金属螯合原理亲和纯化人胱抑素C蛋白，优选原核表达载体为PET-15b。
上述表达宿主细胞为能够表达所述重组表达质粒的宿主细胞，且具有可帮助表达蛋白二硫键形成和增加可溶性的特征，优选表达宿主细胞为大肠杆菌Origami B (DE3)。
本发明还公开了上述制备得到的重组人胱抑素C蛋白在制备单克隆抗体、多抗血清或标准品方面的应用。
本发明公开了一种利用上述方法制备的重组人胱抑素C蛋白作为免疫原，免疫动物制备多抗血清的方法。
所述制备羊多抗血清所用的动物优选为山羊或绵羊，更优选为黑山羊。
本发明还公开了利用上述方法得到的重组人胱抑素C蛋白制备诊断试剂用标准品，将本发明制备的重组人胱抑素C蛋白用适当缓冲液稀释到合适浓度。
所述的合适浓度为5-15mg/L,优选为10mg/ml,以此标准品按梯度稀释,在O. 4mg/ L 8. Omg/L范围内，线性偏差< 10%。
本发明的创新和有益效果是本发明运用基因工程技术表达纯化得到的重组人胱抑素C蛋白具有很极佳的可溶性，可以大量稳定生产，利用蛋白酶切割后获得的重组人胱抑素C蛋白，具有与天然人胱抑素C蛋白一致的活性，可用于免疫制备单克隆抗体和多抗血清，为制备稳定的人胱抑素C检测试剂及其质控品提供了优良的原料，解决了我国人胱抑素C免疫检测试剂盒自主研发的关键问题。
图1是本发明实施例1中制备人胱抑素C蛋白的流程示意图2是本发明实施例5中制备的人胱抑素C诊断标准品评价结果；
图3是本发明实施例6中重组蛋白免疫制备的羊多抗和天然蛋白免疫制备的羊多抗测定标准品曲线对比图。
具体实施方式
采用传统的从胎盘、尿液等组织中提取天然胱抑素制备得到胱抑素C蛋白的方法存在效率低、纯度低、纯化成本高等问题，具体来说，天然提取的人胱抑素C蛋白一般来源于新鲜人血清中，血清来源受到限制，而且存在未知的潜在风险，同时纯化步骤复杂，要得到高纯度蛋白难度很大，用这种天然蛋白免疫制备的多抗血清，和人血清中其他组分的交叉也比较严重，这给产品性能优化带来较大困难。而本发明不同于传统方法，采用了基因工程大肠杆菌重组表达胱抑素C蛋白，并将该重组蛋白通过蛋白酶酶切处理，得到具有与天然胱抑素C蛋白活性一致的重组胱抑素C蛋白。该方法表达的重组蛋白活性高、产量高、易纯化，且生产周期短、成本低，可实现蛋白质的工业化生产。
本发明中制备人胱抑素C蛋白的具体步骤主要包括合成人胱抑素C的DNA序列， 并将其与表达质粒重组，重组子经过DNA测序验证，质粒酶切验证，确定重组表达质粒的序列和阅读框均正确。再将所获得的重组表达质粒转化表达宿主细胞，培养宿主细胞并从细胞质中回收和纯化可溶性重组人胱抑素C蛋白。接着用蛋白酶切割所获得的重组人胱抑素 C蛋白，得到具有天然活性的重组人胱抑素C蛋白。
本发明人经实验发现，采用原核表达方式表达得到的胱抑素C蛋白，在未经酶切处理时，其酶活和免疫原性多比天然胱抑素C蛋白要差很多，无法满足其作为免疫试剂原料的要求。而通过将表达后的胱抑素C蛋白通过蛋白酶酶切处理，很好的解决了胱抑素C 蛋白的酶活性和免疫原性不足的问题，使其具有与天然胱抑素C蛋白相当的活性水平。
在本发明的一个实施例中，优选胰蛋白酶为切割胱抑素C蛋白的蛋白酶，该胰蛋白酶可为任何物种的、包括天然提取和基因工程重组的胰蛋白酶，本发明中优选重组人胰蛋白酶。该酶价格便宜，运用广泛，来源丰富，并且带有His纯化标签的重组人胰蛋白酶可以在酶切完成后，通过镍柱(Ni柱)亲和纯化一步去除，同时在酶切过程中，使用胰蛋白酶切割，目的蛋白最终的损失也是最小的。
采用胰蛋白酶切割重组人胱抑素C的方法具体为在纯化的蛋白样品中加入胰蛋白酶，重组人胱抑素C蛋白胰蛋白酶质量比为50 I 1000 1，30-37度切割5-30min， 亦或4度作用20-28h (优选24h)。产生具有天然活性重组人胱抑素C蛋白。在该比例范围内，如果胰蛋白酶用量提高，则相应的切割速率会提高，作用时间应缩短，否则有可能导致目的蛋白的大量降解。此外，胰蛋白酶过高会导致酶切过程难以控制，重复性差，而过少则会导致酶切不彻底，作用时间过长，蛋白活性受到损失。
使用本发明其他蛋白酶在用量和酶切条件上会有细微差别，但基本涵盖在本发明使用重组人胰蛋白酶所列的条件范围之内。在本发明的另一个实施例中采用的蛋白酶为凝血酶。
本发明中，优选人胱抑素C蛋白具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列，在本发明的一个实施例中，所述人胱抑素C蛋白由SEQ ID NO:1所示核酸序列编码表达。本领域技术人员应该知晓，本发明中所述重组的人胱抑素C蛋白不仅局限于SEQ ID NO :2所示氨基酸序列，在其他报道中公开的、与本发明中SEQ ID NO :2所示序列类似的人胱抑素C蛋白氨基酸序列也同样适用于本发明。同理，适用于本发明的编码表达的人胱抑素C蛋白的核酸序列也不仅限于SEQ ID NO :1，本领域技术人员也可以采用现有报道中或人工合成其他类似SEQ ID NO 1的核酸序列。
本发明中采用的表达载体为能与人胱抑素C蛋白的基因序列重组并形成表达质粒的表达载体，具体地，表达载体为原核表达载体，该原核表达载体的融合蛋白标签可利用金属螯合原理亲和纯化人胱抑素C蛋白，在本发明的一个实施例中，该原核表达载体优选 PET-15b。
本发明中采用的表达宿主细胞为能够表达所述重组表达质粒的宿主细胞，且具有可帮助表达蛋白二硫键形成和增加可溶性的特征，在本发明的一个实施例中，优选用大肠杆菌Origami B (DE3)。所述培养宿主细胞所用的培养基采用含抗生素基础培养基扩增培养宿主细胞，培养温度35-40度，培养时间4-16h，诱导温度20-37度，诱导时间3_6h，诱导物异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)终浓度为O. 2-lmM。筛选宿主细胞中高效表达的阳性表达菌株作为工程菌，重组可溶性人胱抑素C蛋白通过工程菌诱导培养后、离心收集菌体，超声破碎后离心分离上清，经过Ni柱亲和纯化得到重组人胱抑素C蛋白。
本发明还公开了上述制备得到的重组人胱抑素C蛋白在制备单克隆抗体、多抗血清和标准品方面的应用。
在本发明的一个实施例中，公开了一种利用上述方法制备的重组胱抑素C蛋白作为免疫原，免疫动物制备多抗血清的方法。所述制备羊多抗血清所用的动物优选为山羊或绵羊，更优选为黑山羊。在本发明的另一个实施例中还公开了制备的重组人胱抑素C蛋白制备诊断试剂用标准品的方法，即将本发明制备的重组人胱抑素C蛋白用适当缓冲液稀释到合适浓度。所述的合适浓度为5-15mg/L，优选为10mg/ml，以此标准品按梯度稀释，在 O. 4mg/L 8. Omg/L范围内，线性偏差< 10%。
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例1制备重组人胱抑素C蛋白
(I)人工合成人胱抑素C基因并构建表达质粒
按照已报道的胱抑素C基因序列，设计重叠PCR引物人工合成人胱抑素C基因，其序列如SEQ ID N0:1所述。将该基因和PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，PCR 鉴定正确的阳性质粒，提取质粒酶切鉴定。将PCR鉴定和酶切鉴定都正确的质粒送invagen 公司测序，结果和设计序列完全一致。将测序正确的质粒用设计在其两端的酶切位点相应的酶进行酶切，切出的目的序列连入PET-15b载体中，构建原核表达质粒 PET-15bCysC，转化表达宿主菌Origami B (DE3)。
(2)筛选高效表达重组人胱抑素C蛋白菌株
取适量转化后宿主菌涂布于带抗性的LB固体培养基中，37°C，培养过夜，第二天挑取5株以上在抗性培养基中能生长的菌落，接种于2ml带抗性的LB液体培养基中，37°C， 200rpm培养过夜，同时取转化有空载体PET_15b的宿主菌做对照。加入终浓度为ImM的 IPTG，37°C，190rpm诱导培养6h。离心收集菌体，用50 μ I 20mM PBS缓冲液重悬菌体，加入 Buffer，沸水煮10分钟后，SDS-PAGE电泳。考马斯亮兰染色，转化进PET_15bCysC质粒的菌株在预测的分子量位置有一条较浓的蛋白条带，而只转化进PET-15b质粒的菌株没有该条带。进一步将诱导后菌体超声破碎后离心取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳显示，目的蛋白主要以可溶形式存在于上清中。
(3)扩大培养及目的蛋白的纯化
将1%的转化宿主菌接种于IOml加有抗性的LB培养基中，37°C，200rpm培养过夜，第二天按5%接菌量接种于500ml，带抗性的LB培养基中，37°C，200rpm培养5_6小时至0D0. 6-0. 8，加入IPTG至终浓度为ImM，37°C，200rpm诱导5_6h。离心收集菌体，加入适量裂解缓冲液，超声破碎后离心取上清，用50%硫酸铵沉淀蛋白，离心收集沉底，用20mM PBS复溶沉淀，用O. 45 μ M膜过滤备用。
镍琼脂糖凝胶FF柱亲和纯化目的蛋白，用10倍柱体积20mM PBS平衡柱子，上述过滤上清直接上柱，4-10°C结合lh。用20mM PBS洗涤结合后柱子，至0D280吸收值至基线， 用Elusion Bufer (20mM PBS，200mM咪唑，pH7. 4)洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE分析纯度，结果显示纯度达95%以上，蛋白浓度约2-2. 5mg/ml。
(4)胰蛋白酶切割重组人胱抑素C蛋白
将上述纯化的重组人胱抑素C蛋白用酶切缓冲液(20mM Tris-HCl，150mMNaCl， pH8. O)透析过夜，按重组胱抑素C蛋白胰蛋白酶质量比100 I的比例加入重组胰蛋白酶，37°C水浴酶切20min。酶切完样品用O. 5M NaOH调pH至9. 5，4°C放置I小时，以使胰蛋白酶彻底灭活。酶切后蛋白用20mM PBS透析过夜，上镍琼脂糖凝胶FF柱结合lh，反向亲和除去带有his标签的切除部分和残留的重组胰蛋白酶，收集结合完后的流穿蛋白样品，即为最终纯化的重组人胱抑素C蛋白，SDS-PAGE电泳分析，蛋白纯度达95%以上。
(5)免疫双扩散评价重组人胱抑素C蛋白活性
琼脂板的制备将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂4ml，倾注于载玻片上，使其自然流成水平面。待琼脂凝固后，用打孔器在中间打一孔，周围对称打6空，孔径 3mm，孑匕距距15mm。
加样于中央孔加入羊抗人胱抑素C血清(Dako)，将未经酶切处理的重组胱抑素 C蛋白、酶切处理后的重组胱抑素C蛋白及天然胱抑素C蛋白分别以起始浓度1. Omg/ml,由 I 2开始对倍稀释加入周围5孔中，6孔加入生理盐水作对照。
扩散将琼脂板放入湿盒内置37°C温箱中24小时后取出观察结果(表一)。
表一 PET-15bCysC酶切前后活性比较
权利要求
1.一种人胱抑素C蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括将人胱抑素C核酸序列与表达载体重组后转化表达宿主细胞，培养宿主细胞后收集纯化重组表达的人胱抑素C蛋白，再将得到的重组人胱抑素C蛋白进行蛋白酶酶切处理。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶选自胰蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、内肽酶Lys-C、Xa因子、内肽酶Arg-C中的任一种；所述蛋白酶包括天然提取及其基因工程重组蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶酶切中重组人胱抑素C蛋白与蛋白酶的质量比为50 I 1000 I。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶酶切于30 37°C切割5-30分钟，或3 5°C条件下切割20-28小时。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达的人胱抑素C蛋白具有SEQ ID NO 2所不氣基酸序列。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达的人胱抑素C蛋白的核酸序列如SEQ ID NO 1所示。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，表达载体为原核表达载体，且该原核表达载体的融合蛋白标签可利用金属螯合原理亲和纯化人胱抑素C蛋白，所述原核表达载体进一步优选为PET-15b。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述表达宿主细胞为能够表达所述重组表达质粒的宿主细胞，且具有可帮助表达蛋白二硫键形成和增加可溶性的特征，所述表达宿主细胞进一步优选大肠杆菌Origami B (DE3)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备得到的重组人胱抑素C蛋白。
10.根据权利要求9所得到的重组人胱抑素C蛋白在制备单克隆抗体、多抗血清或标准品方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有天然活性的重组人胱抑素C蛋白及其制备方法。本发明运用基因工程技术表达纯化大量稳定的重组人胱抑素C蛋白，并利用蛋白酶切割重组人胱抑素C蛋白使其具有天然活性。该重组人胱抑素C蛋白可用于免疫制备单克隆抗体和多抗血清，为制备稳定的胱抑素C检测试剂及其质控品提供了优良的原料。
文档编号G01N33/68GK103014047SQ20111030178
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者崔鹏, 李泓彦, 何志强, 胡鹏, 杨耿周, 范凌云 申请人:深圳市菲鹏生物股份有限公司