一种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种钩虫病，具体来说是一种快速检测钩虫 病感染的免疫层析试条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 钩虫病（Ancylostomiasis)包括十二指肠钩虫病和美洲钩虫病，分别由十二指肠 钩 口线虫（Ancylostoma Duodenale)和美洲板 口线虫（Necator Americanus)寄生于人体 所引起。钩虫病在临床上可分为钩蝴皮肤（粘膜）侵入期、钩蝴肺部移行期和成虫肠道寄 生期。钩虫感染不仅可导致儿童营养不良、贫血、生长迟缓、智力受损等，从而严重危害儿童 生长发育，亦可引发成人尤其是孕妇贫血、营养不良、胃肠功能紊乱、劳动能力下降，严重时 可致发育障碍或心功能不全。
[0003] 钩虫病呈全球性分布，约7. 95亿人感染。钩虫感染引起的育龄期妇女DALYs损 失远超过淋巴丝虫病、日本脑炎和疟疾的总和。我国也是钩虫病流行较严重的国家。据 2004年第二次全国人体重要寄生虫病现状调查显示，我国钩虫感染率为6. 12%，感染人数 达3930万。因此，钩虫病是严重危害人们健康的重要公共卫生问题，精确、敏感、特异诊断 对于钩虫病防治非常关键。病原学方法、分子生物学方法和免疫学方法在钩虫病的诊断中 均有应用。
[0004] 钩虫病的病原学检查方法很多，包括虫卵检查、幼虫培养及成虫检验等，其中虫卵 检查法应用最为普遍。直接涂片法是直接将粪便涂片镜检发现虫卵而确诊，此方法虽然简 便，但检出率低，轻度感染者易漏检。目前最为普遍使用的技术是加藤厚涂片法检查患者粪 便中的虫卵，因这一方法大量增加了涂片的粪便量，从而显著提高了检出率，并且可以进行 虫卵计数，进行钩虫感染度的划分。此方法简便、成本低廉，特别适合大规模检查，但对专 业人员要求高，且对低感染度的标本易漏检。
[0005] 利用实时荧光PCR技术等分子生物学方法可以应用于敏感、特异检测和鉴定不 同类型的钩虫感染，但此方法对仪器设备、技术操作等有较高要求，不适用于钩虫病的快速 诊断、大规模监测和流行病学调查。
[0006] 免疫学方法在钩虫病诊断上的应用越来越受到重视，最有效的免疫学诊断方法 是应用纯化天然抗原或重组抗原检测钩虫病人特异抗体，常用检测方法有间接酶联免疫 吸附法（ELISA)、酶联免疫电转移印渍法（Enzyme-linked immunoel ectrotransfer blot assay ;EITBA),以及金标免疫点印渍法（Gold-labelled dot blotting;⑶B ;俗称膜法或 渗滤法）。但这些方法或费时费力、或需要冷链系统保存试剂、或对仪器设备及操作人员的 要求较高而不适合现场使用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条及其制备方法， 所述的这种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条及其制备方法要解决现有技术中的检测 钩虫病的方法对仪器设备及操作人员的要求较高、而且不适合现场使用的技术问题。
[0008] 本发明提供了一种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条，包括：
[0009] 样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、与所述金标垫 紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上远离金 标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，所述的检测线 由钩虫纯化虫体抗原组成，所述的钩虫纯化虫体抗原为来源于美洲钩虫成虫虫体的可溶性 抗原液；所述的胶体金标记探针为金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)或链球菌G蛋白（SPG);所 述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的抗体组成。
[0010] 进一步的，所述的胶体金标记探针为链球菌G蛋白（SPG)，所述的质控线上设置有 抗链球菌G蛋白抗体。
[0011] 进一步的，所述的钩虫成虫虫体的可溶性抗原液蛋白浓度为1~20mg/mL，喷涂量 为100 μ L/cm2;胶体金标记探针浓度（以蛋白浓度计）~5mg/15~20mL ;抗SPA抗体溶 液浓度为〇. 1~5mg/mL，喷涂量为100 μ L/cm2。
[0012] 进一步的，所述支持检测线和质控线的纤维素膜可为硝酸纤维素膜（NC膜）或醋 酸纤维素膜；所述支持胶体金标记探针的金标垫为玻璃纤维膜或聚脂膜；所述样品垫可以 是滤血膜样品垫，所述的滤血膜是棉籽绒和纤维素的混合物或者玻璃纤维和纤维素的混合 物，适合于全血样品和血清样品；所述样品垫也可以是玻璃纤维或吸水纸样品垫，适合于血 清样品；所述吸水垫由吸水材料制备，如吸水纸。
[0013] 进一步的，所述纤维素膜宽度控制在2. 5~3. Omm ;所述吸水垫的宽度为20~ 40mm，厚度为0· 1~0· 2mm ;所述金标垫的宽度为5~IOmm ;所述样品垫宽度为20~40mm。
[0014] 进一步的，所述免疫层析试条背面可设置一个起支撑作用的背板，背板材料的选 择是多种多样的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板（PVC)等。
[0015] 进一步的，可将所述带有背板的免疫层析试条装入一个盒体中，该盒体对应于滤 血膜样品垫的部位设有检测孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。检测样品时将 全血或血清加入检测孔中。
[0016] 本发明还提供了一种制备上述检测钩虫病感染的免疫层析试条的方法，包括以下 步骤：
[0017] (1) -个制备钩虫纯化虫体抗原溶液的步骤，将来源于美洲钩虫成虫虫体可溶性 抗原液蛋白浓度调整到1~20mg/mL ;
[0018] (2) -个制备胶体金标记探针的步骤，将1~5mg金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)或 链球菌G蛋白加入IOOmL胶体金溶液中，离心取沉淀，复溶到15~20mL mg/mL ;
[0019] (3) -个制备与胶体金标记探针特异结合的抗体的步骤，所述的与胶体金标记探 针特异结合的抗体特异性的结合金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)或链球菌G蛋白（SPG)，将与 胶体金标记探针特异结合的抗体的溶液浓度调整到〇. 1~5mg/mL ;
[0020] (4)将钩虫纯化虫体抗原溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将能与胶体金标记探 针特异结合的抗体溶液喷到所述纤维素膜的另一区域形成质控线；
[0021] (4)将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记探针溶液，制备金标垫；
[0022] (3)将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离检测线的一端，将金标垫粘贴在纤维素 膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫上与所述纤维素膜相对的一端。
[0023] 进一步的，上述纤维素膜在喷有检测线、质控线后，先在25~40°C下干燥0. 5~2 小时，再粘贴吸水垫。
[0024] 进一步的，为使胶体金标记探针溶液与玻璃纤维膜或聚脂膜更好地结合，可向胶 体金标记探针溶液中添加质量百分比浓度为2%~10%的蔗糖；为使金标垫更易于纤维素 膜粘贴，可将金标垫在25~40°C下干燥0. 5~1小时，再与纤维素膜粘贴。
[0025] 本发明还提供了一组用于免疫学方法检测钩虫病的试剂，包括：（1)钩虫纯化抗 原，（2)金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)或链球菌G蛋白（SPG)标记物；所述的钩虫纯化虫体 抗原按如下方法制备：收集美洲钩虫成虫1000~2000条，用磷酸缓冲液反复洗涤，将虫体 置于预冷的研钵内，不断倒入液氮充分研磨，再加入虫体压积15~25倍体积的浸泡液浸泡 冲洗虫体，所述的浸泡液由正辛基葡糖苷、苯甲基磺酰氟、甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、乙二胺 四乙酸、乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸组成，在所述的浸泡液中，正辛基葡糖苷的质量百 分比浓度为1. 5%，所述的苯甲基磺酰氟的浓度为ImM、所述的甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮的浓 度为0.2mM，所述的乙二胺四乙酸的浓度为ImM，所述的乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸的 浓度为1禮，然后在液氮和30~40°C反复冻融5~8次，冰浴过夜，离心，上清液在磷酸缓冲 液中透析48~72小时，透析完成后，在溶液中加入硫酸铵至60~75%的饱和度并产生沉 淀，离心，弃上清，沉淀用磷酸缓冲液复溶，在磷酸缓冲液中透析10~20小时，回收透析液， 离心，上清即是钩虫纯化虫体抗原可溶性抗原，所述的标记包括酶标记、胶体金标记或者其 他标记。
[0026] 钩虫病患者体内血液中含有能特异性结合所感染的钩虫成虫虫体抗原的抗钩虫 抗体，检测受试者体内血液中是否含有钩虫虫体抗体，可作用受试者是否患