有钩虫的指标。
[0027] 本发明的的检测钩虫病感染的免疫层析试条适用于从钩虫病感染者（患畜）体内 抽取的全血样品和血清样品。对于全血样品，本发明的检测钩虫病感染的免疫层析试条中 的样品垫采用滤血膜样品垫；对于血清样品，本发明的检测钩虫病感染的免疫层析的免疫 层析试条中的样品垫可采用玻璃纤维或吸水纸样品垫，也可采用滤血膜样品垫。
[0028] 将钩虫虫体可溶性抗原固定在纤维素膜等支持物上作为固相抗原，用以捕获受试 者者血样中的抗钩虫抗体。本发明的一个优选的方案中，将美洲钩虫成虫可溶性抗原固定 在纤维膜上形成检测线，该固相抗原可以捕获受试者血样中相应的钩虫抗体，在检测线位 置形成抗原抗体复合物沉淀。
[0029] 钩虫病患者体内血液中含有的抗钩虫抗体的优势抗体类型为IgG抗体。本发明的 一个优选的方案中采用胶体金标记的链球菌G蛋白作为检测探针，该胶体金标记探针附着 于金标垫上。检测过程中，复溶的胶体金标记探针可与受试者血样中的人IgG抗体结合，从 而当受试者血样中存在钩虫特异性抗体时在检测线位置形成色带。
[0030] 胶体金标记探针不限于链球菌G蛋白，也可采用金黄色葡萄球菌A蛋白，鼠抗人 IgG的单抗或多抗，或者采用其他动物如兔抗人IgG抗体，同样能实现本发明的发明目的 (若使用抗人的抗体则仅能对人体进行诊断），这是领域的一般技术人员都知晓的。）
[0031] 将与胶体金标记探针特异性结合的抗体固定在纤维素膜上作为质控线。在本发明 一个优选的方案中，胶体金标记探针是链球菌G蛋白（SPG)，相应的，质控线采用抗SPG的抗 体。无论待检样品中是否含有钩虫抗体，本发明的检测钩虫病感染中质控线位置总能形成 色带，该条色带是判定检测过程是否正常和免疫层析试条是否变质的标准。
[0032] 质控线不限于抗SPG的抗体，只要能与选定的胶体金标记抗体特异性结合，或者 使用SPG能结合的任意IgG抗体，同样能实现本发明的发明目的，这是领域的一般技术人 员都知晓的。
[0033] 本发明的免疫层析试条具有以下优点：（1)敏感性及特异性高：实验室考核结果 显示，本发明的免疫层析试条总的敏感性可达95. 3 %，特异性为98. 6 % ; (2)检测方法简 单、快速：检测过程中标本处理简单，血清或全血都可以直接使用，无需处理，不需要专门仪 器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的抗体经 5分钟左右的纸层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为钩虫病人的治疗争取了时间， 很适合现场和基层使用；（3)本发明的免疫层析试条可以同时应用与人、畜和野生动物感 染的现场检测，有助于寻找确定传染源，在疾病预防控制工作中有重要意义；(4)制备方法 简单，成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在检测钩虫病感染及其相关疾病的诊断 和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。
【附图说明】
[0034] 图1是本发明的快速检测钩虫病感染的免疫层析试条的俯视结构示意图。
[0035] 图2是本发明的快速检测钩虫病感染的免疫层析试条的纵截面结构示意图。
[0036] 其中：1为样品垫；2为金标垫；3为纤维素膜；4为吸水垫；5为检测线；6为质控 线；7为背板。
【具体实施方式】
[0037] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所述百 分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。
[0038] 实施例1、检测钩虫病感染的免疫层析试条的制备
[0039] 1、针对钩虫纯化抗原的制备
[0040] 收集美洲钩虫成虫2000条左右，用磷酸缓冲液反复洗涤，将虫体置于预冷的研钵 内不断倒入液氮充分研磨。再加入虫体压积20倍体积的含1. 5%正辛基葡糖苷、ImM苯甲 基磺酰氟、〇. 2mM甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、ImM乙二胺四乙酸、ImM乙二醇双（2-氨基乙醚） 四乙酸浸泡冲洗收集的虫体材料，在液氮和37°C反复冻融5次，冰浴过夜。26000g、4°C离心 30分钟，上清液对磷酸缓冲液透析48小时。在溶液中加入硫酸铵至70%的饱和度并产生 沉淀，，冰浴过夜。26000g、4°C离心30分钟，弃上清，沉淀用少量磷酸缓冲液复溶，对磷酸缓 冲液透析12小时，回收透析液，1000g、4°C离心10分钟离心，上清即是钩虫纯化虫体抗原 可溶性抗原。
[0041] 2、链球菌G蛋白（SPG)由上海业力生物科技有限公司购买获得。
[0042] 3、制备免疫胶体金探针及金标垫
[0043] 用下述方法制备链球菌G蛋白免疫胶体金探针及金标垫：
[0044] 1)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl4 (沪试牌，购于 上海国药集团化学试剂有限公司）配制成0.01%水溶液，取IOOmL加热至沸腾，搅动下准确 加入I. 6mL的1%的柠檬酸三钠水溶液，待液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液。
[0045] 2)确定胶体金偶联探针饱和浓度
[0046] 用0· 2M K2CO3调节步骤1)制备的胶体金溶液的pH值至6. 0,准备5支洁净试管， 分别加入ImL胶体金溶液。将步骤1)制备的经纯化的链球菌G蛋白稀释为lmg/mL，分别 向4支试管中加入5 μ L、10 μ L、20 μ L、30 μ L，另一支为空白对照，混匀后于室温下放置5分 钟，加入10% NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时 所含最少量即为稳定ImL胶体金溶液所需蛋白的最适浓度，以此为基础增加20%蛋白量即 为胶体金探针饱和溶液。结果：维持胶体金溶液颜色不变的蛋白量为10 μ L，即探针浓度为 10 μ g/mL〇
[0047] 3)链球菌G蛋白标记的免疫胶体金探针及金标垫的制备
[0048] 取50mL胶体金溶液，用0. 2M K2CO3调节pH值为6. 0,按10 μ g/mL加入已纯化的 链球菌G蛋白，得到含有浓度为10 μ g/mL链球菌G蛋白的免疫胶体金探针溶液50mL，搅拌 1小时，再加入终浓度为〇. 05% PEG20000,搅拌1小时，1000 Orpm离心30分钟，弃上清，用 20mM硼酸缓冲液洗涤沉淀，并将其保存于IOmL含15 %蔗糖的20mM硼酸缓冲液中，得到链 球菌G蛋白标记的胶体金探针溶液。取5mL链球菌G蛋白标记的胶体金探针溶液均匀加在 玻璃纤维膜上，37°C下干燥0. 5小时，得到金标垫。
[0049] 4、检测钩虫病感染的免疫层析试条的制备
[0050] 该试条的制备方法包括以下步骤：
[0051] I) NC膜的包被
[0052] 钩虫虫体可溶性纯化抗原包被：用0.0 lM pH7. 2PBS稀释实施例1制备的钩虫虫体 可溶性纯化抗原液至终浓度为5mg/mL，用于包被检测线；
[0053] 质控抗体鸡抗链球菌G蛋白IgY (购自捷宁生物公司）的包被：用0· OlM pH7. 2PBS 稀释鸡抗链球菌G蛋白IgY至终浓度为0. 5mg/mL，用于包被质控线；
[0054] BIODOT公司XZ1000喷膜机将分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜（购自 Sartorius公司）上，喷涂量均为100 μ L/cm2,形成一条检测线和一条质控线，37°C下干燥1 小时。
[0055] 2)检测钩虫病感染的免疫层析试条的制备
[0056] 用一块单面涂了不干胶的PVC背板7,中间粘贴上处理好的NC膜3 ;硝酸纤维素 膜3上设有检测线5和质控线6 ;NC膜3靠近质控线6的一端紧密粘贴吸水垫4(购于 MILLIP0RE公司）；NC膜3靠近质控线6的一端紧密粘贴金标垫2 ;金标垫2另一端紧密粘 贴滤血膜样品垫1 (购自WHATMAN公司）。
[0057] 测定时将样本血清或全血加在滤血膜样品垫1上，10秒后滴一滴（约50 μ L)样本 稀释液，稀释液带动样品按样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4的方向移动，流经 金标垫2时使金标垫2上的胶体金标记探针复溶，并带动其向硝酸纤维素膜3、吸水垫4移 动。胶体金标记探针（本发明实施例为链球菌G蛋白）可与样品中的抗体或抗体亚类结合， 形成免疫复合物。此免疫复合物流至检测线5时，若标本中有待测抗体或抗体亚类（抗钩 虫虫体抗原的抗体），即被检测线5的特异性固相抗原所捕获，在硝酸纤维素膜3上的检测 线5