位置显出红色检测线条；此免疫复合物流经质控线6时，即被质控线6的固相抗体（本 发明实施例为抗SPG抗体）所捕获，在硝酸纤维素膜3上的质控线6位置显出红色质控线 条。
[0058] 阳性标本既显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质控线。
[0059] 5、检测钩虫病感染的免疫层析试剂盒的制备
[0060] 为了方便使用，将步骤3制备的检测钩虫病感染的免疫层析的免疫层析试条装入 试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样孔，对应于检测线 和质控线的部位设有观测窗。
[0061] 实施例2、检测钩虫病感染的免疫层析试条的制备
[0062] 用购买自上海业力生物科技有限公司的金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)制备胶体金 标记检测探针，用购买自捷宁生物公司的鸡抗金黄色葡萄球菌A蛋白IgY包被质控线，其他 步骤同实施例1。
[0063] 实施例3、检测钩虫病感染的免疫层析试条的实验室考核
[0064] 1、检测方法
[0065] 于实施例1制备的免疫层析试条的滤血膜样品垫加入待测血清，1分钟后加入样 本稀释液（PBS) 1滴（约50 μ L)，2分钟后开始观察结果，20分钟观察终止。结果判定：如 果检测线5和质控线6均出现红色条带，即判为钩虫病，如果仅有质控线6出现红色条带， 即判为阴性。
[0066] 2、实验结果
[0067] 用本发明实施例2制备的检测钩虫病感染的免疫层析的免疫层析试条进行实验 室考核结果如表1所示。由表1可以看出本发明的免疫层析试纸的敏感性可达87. 2%，特 异性可达96. 5%。上述检测结果表明本发明的免疫层析试条可用于钩虫病的快速检测。
[0068] 表1本发明检测钩虫病感染的实验室考核结果
[0069]
[0070] 用本发明实施例3制备的检测钩虫病感染的免疫层析试条进行实验室考核，结果 与表1所示结果没有统计学差异。
[0071] 本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各 个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的 内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所 述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
【主权项】
1. 一种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条，其特征在于，包括： 样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、与所述金标垫紧密 连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上远离金标垫 的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，所述的检测线由钩 虫纯化虫体抗原组成，所述的钩虫纯化虫体抗原为来源于美洲钩虫成虫虫体的可溶性抗原 液；所述的胶体金标记探针为金黄色葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白；所述的质控线由特 异性结合胶体金标记探针的抗体组成。2. 根据权利要求1所述的一种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条，其特征在于：所 述的钩虫成虫虫体的可溶性抗原液蛋白浓度为1~20mg/mL，喷涂量为lOOML/cm 2;胶体金 标记探针浓度（以蛋白浓度计)：1~5mg/ 15~20mL ;抗SPA抗体溶液浓度为0. 1~5mg/ mL，喷涂量为 100ML/cm2。3. 根据权利要求1所述的一种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条，其特征在于：所 述免疫层析试条背面可设置一个起支撑作用的背板，所述的带有背板的免疫层析试条装入 一个盒体中，所述的盒体对应于滤血膜样品垫的部位设有检测孔，对应于检测线和质控线 的部位设有观测窗，检测样品时将全血或血清加入检测孔中。4. 一种制备权利要求1所述的快速检测钩虫病感染的免疫层析试条的方法，其特征在 于，包括以下步骤： 1) 一个制备钩虫纯化虫体抗原溶液的步骤，收集美洲钩虫成虫1〇〇〇~2000条，用磷 酸缓冲液反复洗涤，将虫体置于预冷的研钵内，不断倒入液氮充分研磨，再加入虫体压积 15~25倍体积的浸泡液浸泡冲洗虫体，所述的浸泡液由正辛基葡糖苷、苯甲基磺酰氟、甲苯 磺酰赖氨酰氯甲酮、乙二胺四乙酸、乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸组成，在所述的浸泡液 中，正辛基葡糖苷的质量百分比浓度为1. 5%，所述的苯甲基磺酰氟的浓度为ImM、所述的甲 苯磺酰赖氨酰氯甲酮的浓度为〇. 2禮，所述的乙二胺四乙酸的浓度为ImM，所述的乙二醇双 (2-氨基乙醚）四乙酸的浓度为ImM，然后在液氮和30~40°C反复冻融5~8次，冰浴过夜，离 心，上清液在磷酸缓冲液中透析48~72小时，透析完成后，在溶液中加入硫酸铵至60~75%的 饱和度并产生沉淀，冰浴过夜，离心，弃上清，沉淀用磷酸缓冲液复溶，在磷酸缓冲液中透析 10~20小时，回收透析液，离心，上清即是钩虫纯化虫体抗原可溶性抗原，将钩虫成虫虫体可 溶性抗原液蛋白浓度调整到1~20mg/mL ; 2) -个制备胶体金标记探针的步骤，将1~5mg金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)或链球 菌G蛋白加入IOOmL胶体金溶液中，离心取沉淀，复溶到4~25 mg/mL ; 3) -个制备与胶体金标记探针特异结合的抗体的步骤，所述的胶体金标记探针特异结 合的抗体特异性的结合金黄色葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白，将与胶体金标记探针特异 结合的抗体的溶液浓度调整到〇. 1~5mg/mL ; 4) 将钩虫纯化虫体抗原溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将能与胶体金标记探针特异 结合的抗体溶液喷到所述纤维素膜的另一区域形成质控线； 5) 将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记探针溶液，制备金标垫； 6) 将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离检测线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠 近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫上与所述纤维素膜相对的一端。5. 根据权利要求4所述的一种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条的制备方法，其特 征在于：上述纤维素膜在喷有检测线、质控线后，先在25~40°C下干燥0. 5~2小时，再粘贴 吸水垫。6. 根据权利要求4所述的一种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条的制备方法，其 特征在于：向胶体金标记探针溶液中添加质量百分比浓度为5%~20%的蔗糖，将金标垫在 25~40°C下干燥0. 5~1小时，再与纤维素膜粘贴。7. -组用于免疫学方法检测钩虫病的试剂，其特征在于包括：（1)钩虫纯化抗原，（2) 金黄色葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白标记物；所述的钩虫纯化虫体抗原按如下方法制备： 收集美洲钩虫成虫1〇〇〇~2000条，用磷酸缓冲液反复洗涤，将虫体置于预冷的研钵内，不断 倒入液氮充分研磨，再加入虫体压积15~25倍体积的浸泡液浸泡冲洗虫体，所述的浸泡液 由正辛基葡糖苷、苯甲基磺酰氟、甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、乙二胺四乙酸、乙二醇双（2-氨 基乙醚）四乙酸组成，在所述的浸泡液中，正辛基葡糖苷的质量百分比浓度为1. 5%，所述的 苯甲基磺酰氟的浓度为ImM、所述的甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮的浓度为0. 2mM，所述的乙二胺 四乙酸的浓度为ImM，所述的乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸的浓度为ImM，然后在液氮和 30~40°C反复冻融5~8次，冰浴过夜，离心，上清液在磷酸缓冲液中透析48~72小时，透析完 成后，在溶液中加入硫酸铵至60~75%的饱和度并产生沉淀，冰浴过夜，离心，弃上清，沉淀 用磷酸缓冲液复溶，在磷酸缓冲液中透析1〇~20小时，回收透析液，离心，上清即是钩虫纯 化虫体抗原可溶性抗原。
【专利摘要】本发明一种快速检测钩虫病感染的免疫层析试条，包括：样品垫、紧密连接于样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、与金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于纤维素膜另一端的吸水垫；纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，检测线由钩虫纯化虫体抗原组成，钩虫纯化虫体抗原为来源于美洲钩虫成虫虫体的可溶性抗原液；胶体金标记探针为金黄色葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白；质控线由特异性结合胶体金标记探针的抗体组成。本发明还提供了上述的免疫层析试条的制备方法。本发明的免疫层析试条具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，可以同时应用于人、畜及野生动物的临床和现场使用。
【IPC分类】G01N33/558, G01N33/532
【公开号】CN105044335
【申请号】CN201510405625
【发明人】汪俊云, 石锋, 杨玥涛, 高春花, 杨益, 朱慧慧, 陈颖丹
【申请人】中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月10日