一种微流控芯片上基于荧光量子点磁性富集并分离结核分枝杆菌TB的方法及装置与流程

本发明主要涉及一种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)全自动检测与分离的方法和装置，特别涉及在微流控芯片上实现荧光量子点与免疫学反应结合的方法对痰液样品中结核分枝杆菌的全自动检测装置。

背景技术：

21世纪以来全球每年约出现8百万结核新病例，中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多，结核病成为了威胁人类健康的全球性卫生问题。结核分枝杆菌是一种细长略带弯曲的杆菌，无芽孢，无鞭毛，不产生内、外毒素。结核分枝杆菌的致病性与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。结核分枝杆菌是结核病的病原菌，可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。结核病成为威胁人类健康的全球性卫生问题，因此选择一种检测结核分枝杆菌的简便，准确方法，协助临床诊断和治疗是非常必要的。

目前对结核分枝杆菌检测的方法主要有：结核菌素实验、细菌的直接检查法、聚合酶链反应技术等。

结核菌素实验是基于Ⅳ型变态反应原理的一种皮肤试验，可用来检测机体有无感染过结核杆菌。方法是取结核菌素5个单位注射一侧前臂皮内，48～72h后红肿硬结超过5mm者为阳性，≥15mm为强阳性，对临床诊断有意义。若受试者未感染过结核杆菌，则注射局部无变态反应发生。但结核菌素试验会出现多种假阴性结果，比如结核菌感染早期，使用免疫抑制剂者，营养不良、严重结核病和各种危重病人，其他如淋巴细胞免疫系统缺陷(如淋巴瘤、白血病、结节病、艾滋病等)病人和老年人的结素反应也常为阴性。

细菌的直接检查法包括齐尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法、浓缩集菌和分离培养。抗酸染色法是诊断结核分枝杆菌的最可靠的方法，但存在需要将染料加热，操作繁琐费时的弊端。浓缩集菌的步骤是先集菌后检查，从而提高检出率，但操作过程复杂，标本常需特殊处理才可检验。结核分枝杆菌生长缓慢，进行分离培养时一般需2～4周才可长成肉眼可见的落菌，使用这种方法常常使患者得不到尽快的诊疗。细菌的直接检查虽是结核分枝杆菌检测的金标准，但对标本中细菌的数量也有要求，一般涂片检查菌数需达到5x10³～5x10⁴/ml，分离培养菌数需达到1x10²/ml，标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果。以上这些方法给就诊患者带来不便，同时操作过程中人为因素影响较大。

聚合酶链反应技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每ml标本中只需几个细菌即可获得阳性。但实际操作中实验器材的易遭污染，难免出现假阳性。

综上分析，全面、快速、准确的结核分枝杆菌的检测与分离方法是医学领域中亟待解决的重要问题之一，对结核病的筛查、诊断和治疗，都有重要意义。

技术实现要素：

根据上述提出的技术问题，而提供一种微流控芯片上基于荧光量子点磁性富集并分离结核分枝杆菌TB的方法及装置。本发明采用的技术手段如下：

一种微流控芯片上基于荧光量子点磁性富集并分离结核分枝杆菌TB的方法，具有如下步骤：

S1、分别制备表面带有结核分枝杆菌抗体的磁珠、生物素化的结核分枝杆菌单抗(二抗)、结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)；

S2、将生物素化的结核分枝杆菌单抗(二抗)、结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)、痰液样品和清洗液分别放入到微流控芯片的不同的储液池中；

S3、驱动所述痰液样品与所述磁珠在所述微流控芯片的微通道内充分混合，得到了的磁珠抗原抗体复合物；

S4、用电流将所述磁珠抗原抗体复合物固定，电动控制清洗液清洗除去其他未结合物质；

S5、驱动所述结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)与所述磁珠抗原抗体复合物充分混合、反应，得到带有结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)的磁珠抗原抗体复合物，驱动所述清洗液对所述带有结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)的磁珠抗原抗体复合物进行清洗，去除其上的未结合的结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)，得到含有反应产物的磁珠，此时磁珠载体上带有的荧光量子点(QDs)的量与样品中TB的量相关；

S6、激光诱导荧光仪对所述含有反应产物的磁珠进行照射，并测量荧光信号的有无、数量和强度；

S7、当测量到荧光信号时，利用微流控芯片电泳技术将能够产生荧光信号的磁珠分离出来，分析待测样品中的结核分枝杆菌的含量。

所述步骤S6中，根据荧光信号的数量得到结核分枝杆菌的个数，根据荧光信号的强度得到结核分枝杆菌的浓度。

所述清洗液为PBS缓冲液。

本发明还公开了一种微流控芯片上基于荧光量子点磁性富集并分离结核分枝杆菌TB的装置：

包括平台结构、微流控芯片、驱动组件、激发光源、荧光检测器和数据处理组件，所述驱动组件包括多个驱动电机，所述数据处理组件包括微处理器和数据采集卡，

所述微流控芯片包括载玻片和聚二甲基硅氧烷层，所述聚二甲基硅氧烷层上设有微沟道，所述微沟道与所述载玻片相配合形成微通道，

所述微通道包括四个样品储液池、分离样品储液池、废液储液池和主通道，所述主通道包括检测区域、与所述分离样品储液池连通的分离通道和与所述废液储液池连通的废液通道，所述四个样品储液池分别通过微通道与所述检测区域的一端连通，所述检测区域的另一端分别与分离通道和废液通道连通，所述四个样品储液池、所述分离样品储液池和所述废液储液池内均设有所述驱动电极，

所述微流控芯片位于所述平台结构内，所述驱动电极通过继电器模块与所述微处理器电气连接，所述微处理器分别与显示器、数据采集卡和所述激发光源电气连接，所述数据采集卡与所述荧光检测器电气连接。

所述荧光检测器为光电倍增管或单光子计数模块。

所述聚二甲基硅氧烷层上通过软光刻形成所述微沟道。

所述微沟道与所述载玻片分别通过表面等离子体处理后贴附。

本发明具有以下优点：

1、本发明主要是通过在微流控芯片上使用荧光量子点实现全自动快速完成结核分枝杆菌TB的检测与分离，随着纳米生物材料和纳米技术的发展，荧光量子点由于具有较有机荧光素优越的许多独特的光学特性，其激发光波长范围很宽，且稳定性远高于有机染料，适合于体内和体外对病原体和其他目标分子的检测。通过荧光密度进行定量检测，不仅减少了样品和试剂的消耗量，而且避免了多个分析步骤或过程导致的操作繁琐、分析时间过长和样品损失，提高了分析速度、检测准确度和灵敏度；微流控方法检测自动化程度高、操作程序简单，克服了传统方法(例如分离培养)中人工操作带来的耗时长、操作程序复杂以及对操作人员须具备丰富的医学、生物学知识的要求等人为因素的影响；

2、本发明的最主要的特点是采用微流控芯片作为结核分枝杆菌TB检测的微平台，同时所需的相关电动操控、光电检测与分离设备亦采用体积较小、结构精密的操控设备和检测装置，比如使用光电倍增管或单光子计数模块代替CCD或ICCD；用电极驱动代替泵驱动；用微处理器代替PC机等，因此，本发明的检测与分离的装置具有体积小巧、重量轻便、便于携带，可手持使用、用于现场检测等优点。

基于上述理由本发明可在结核分枝杆菌全自动检测与分离等领域广泛推广。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明的实施例2中一种微流控芯片上基于荧光量子点磁性富集并分离结核分枝杆菌TB的装置的结构示意图。

图2是本发明的实施例2中微流控芯片的结构示意图。

具体实施方式

实施例1

一种微流控芯片上基于荧光量子点磁性富集并分离结核分枝杆菌TB的方法，具有如下步骤：

S1、分别制备表面带有结核分枝杆菌抗体的磁珠、生物素化的结核分枝杆菌单抗(二抗)、结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)；

S2、将生物素化的结核分枝杆菌单抗(二抗)、结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)、痰液样品和清洗液分别放入到微流控芯片的不同的储液池中；

S3、驱动所述痰液样品与所述磁珠在所述微流控芯片的微通道内充分混合，得到了的磁珠抗原抗体复合物；

S4、用电流将所述磁珠抗原抗体复合物固定，电动控制清洗液清洗除去其他未结合物质；

S5、驱动所述结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)与所述磁珠抗原抗体复合物充分混合、反应，得到带有结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)的磁珠抗原抗体复合物，驱动所述清洗液对所述带有结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)的磁珠抗原抗体复合物进行清洗，去除其上的未结合的结合链霉亲和素的荧光量子点(QDs)，得到含有反应产物的磁珠，此时磁珠载体上带有的荧光量子点(QDs)的量与样品中TB的量相关；

S6、激光诱导荧光仪对所述含有反应产物的磁珠进行照射，并测量荧光信号的有无、数量和强度；

S7、当测量到荧光信号时，利用微流控芯片电泳技术将能够产生荧光信号的磁珠分离出来，分析待测样品中的结核分枝杆菌的含量。

所述步骤S6中，根据荧光信号的数量得到结核分枝杆菌的个数，根据荧光信号的强度得到结核分枝杆菌的浓度。

所述清洗液为PBS缓冲液。

实施例2

如图1和图2所示，一种微流控芯片上基于荧光量子点磁性富集并分离结核分枝杆菌TB的装置，包括平台结构1、微流控芯片2、驱动组件、激发光源3、荧光检测器4和数据处理组件，

所述微流控芯片2包括载玻片21和聚二甲基硅氧烷层22，所述聚二甲基硅氧烷层22上设有微沟道，所述微沟道与所述载玻片21相配合形成微通道，

所述微通道包括四个样品储液池23、分离样品储液池24、废液储液池25和主通道26，所述主通道包括检测区域261、与所述分离样品储液池24连通的分离通道262和与所述废液储液池25连通的废液通道263，所述四个样品储液池23分别通过微通道27与所述检测区域261的一端连通，所述检测区域261的另一端分别与分离通道262和废液通道263连通，所述四个样品储液池23、所述分离样品储液池24和所述废液储液池25内均设有所述驱动电极28，

所述微流控芯片2位于所述平台结构1内，所述驱动电极28通过继电器模块5与所述微处理器6电气连接，所述微处理器6分别与显示器7、数据采集卡8和所述激发光源3电气连接，所述数据采集卡8与所述荧光检测器4电气连接。

所述数据处理组件包括所述微处理器6和所述数据采集卡8，

所述荧光检测器4为光电倍增管或单光子计数模块。

所述聚二甲基硅氧烷层22上通过软光刻形成所述微沟道。

所述微沟道与所述载玻片21分别通过表面等离子体处理后贴附。

所述检测区域261中含有表面带有结核分枝杆菌抗体的磁珠。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。