一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法与流程

本发明涉及量子点应用领域和生物荧光标记领域，具体涉及一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法。

背景技术：

探索和发现生物体内及生命过程中蛋白质、核酸、多肽等重要生物分子的高灵敏分析检测方法，是生物医学领域研究的热点和难点。生物标记技术是该领域不可或缺的研究手段。通用的生物标记方法可以分为放射性标记、显色标记、酶标记和荧光标记等。其中，荧光标记备受科研人员关注，而其检测灵敏度很大程度上取决于荧光标记探针的发光强度和光化学稳定性。

荧光半导体纳米材料量子点具有发光效率高、光化学稳定性好、发射光颜色与粒径大小关联等优点，作为一种新型荧光标记物可广泛应用于蛋白质及dna检测、细胞标记成像、活细胞生命动态过程示踪、活体动物体内肿瘤细胞靶向示踪等生物医学领域。

现有的生物标记技术主要基于生物素与亲和素之间的非共价相互作用，虽然具有简便、快捷的优点，但是标记产物不稳定。另一种采用基于羧基与氨基的缩合反应的标记方法往往需要添加催化剂，并且由于生物体本身存在大量氨基与羧基，因此反应效率不高，特异性也不好。

目前点击化学应用最为广泛的是铜离子催化的端基炔和叠氮化物huisgen偶极环加成反应。而新型的基于环炔基-叠氮连接的不含铜的新型点击化学方法更为其生物医学应用奠定了良好基础，将点击化学与荧光纳米量子点结合起来可以构建一种稳定的纳米标记探针。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法，解决了现有技术中采用生物标记方法，无论是荧光半导体标记还是基于羧基与氨基的缩合反应标记都普遍存在标记不稳定、标记效率低、影响被标记物的活性，或者标记成本高的问题。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法，包括以下步骤：

步骤一，制备细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液：通过在细胞的培养液中，以1:1的比例添加带有环炔基的点击化学修饰连接剂，在室温下反应30-60分钟得到细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液，其中点击化学修饰连接剂的量为细胞摩尔量的10-100倍；

步骤二，使用叠氮-荧光量子点复合物对细胞进行荧光标记：将叠氮-荧光量子点复合物以1:1的比例加入制备完成的细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液中，室温孵育30-60分钟，得到荧光量子点标记的生物体培养液，其中叠氮-荧光量子点复合物的量为细胞摩尔量的10-100倍。

进一步的，所述叠氮-荧光量子点复合物为cdse、cdte、cds、zns、cuinse、cuins、inp、cdse/zns、cdte/cds、cdte/cdse中的一种或多种。

进一步的，所述细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液制备完成后，加入ph为7.2-7.6的缓冲液对其洗涤，将多余的点击化学修饰连接剂去除。

进一步的，所述荧光量子点标记的生物体培养液制备完成后，加入ph为7.2-7.6的缓冲液对其洗涤，将多余的叠氮-荧光量子点复合物去除，并采用离心的方式收集荧光量子点标记的细胞。

进一步的，所述缓冲液为pbs缓冲液或者hepes缓冲液。

进一步的，所述培养液为dmem培养液。

进一步的，所述叠氮-荧光量子点复合物中，量子点内核为cdse/zns核壳型量子点，外面包裹修饰有叠氮基团聚马来酸酐聚合物n3-pmah。

进一步的，所述叠氮-量子点复合物溶液的制备方法是：

将cdse/zns核壳量子点溶解于氯仿中，然后将聚合物n3-pmah溶解于二甲基亚砜，缓慢加入cdse/zns核壳量子点的氯仿溶液，形成透明溶液；

50℃加热2h，用旋转蒸发除去氯仿，再在90℃加热4h；

降温后，加入氯仿/正己烷=1：1沉淀，6000g离心10min。丙酮洗3次；

重新溶解于ph为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，即得到叠氮-量子点复合物溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：将荧光量子点以共价的方式结合到细胞上，荧光标记稳定、高效，并且能够保持被标记物的活性；并且本发明的方法操作简便，快速易行，为细胞等生物体的长时间观察研究提供了适宜的实验方法。

基于活体细胞的荧光标记，或活体荧光成像技术不需要杀死动物，可以对同一个动物进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果的影响。更重要的是，该技术可以得到直观的成像图片，了解标记物在动物体内的分布和代谢情况，避免了传统的体外实验方法的诸多缺点，特别是在在癌症细胞转移及干细胞相关研究、药物制剂学、药物临床前研究中有不可估量的应用前景。

附图说明

图1为根据本发明对细胞进行荧光量子点标记的原理示意图。

图2为本发明实施例中所用叠氮-量子点复合物的结构示意图。

图3为用于修饰量子点的叠氮聚合物n3-pmah的1hnmr图谱。

图4示出本发明实施例中所用叠氮-量子点复合物的吸收和发射光谱。

图5示出本发明实施例中所用叠氮-量子点复合物的透射电镜图像。

图6a和6b分别为根据本发明对a549细胞和ramos淋巴瘤细胞进行荧光量子点标记后的荧光成像图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1示出了本发明一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法的一个实施例：一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法，包括以下步骤：

步骤一，制备细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液：通过在细胞的培养液中，以1:1的比例添加带有环炔基的点击化学修饰连接剂，在室温下反应30-60分钟得到细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液，其中点击化学修饰连接剂的量为细胞摩尔量的10-100倍；

步骤二，使用叠氮-荧光量子点复合物对细胞进行荧光标记：将叠氮-荧光量子点复合物以1:1的比例加入制备完成的细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液中，室温孵育30-60分钟，得到荧光量子点标记的生物体培养液，其中叠氮-荧光量子点复合物的量为细胞摩尔量的10-100倍。。

根据本发明一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法的一个实施例，所述叠氮-荧光量子点复合物为cdse、cdte、cds、zns、cuinse、cuins、inp、cdse/zns、cdte/cds、cdte/cdse中的一种或多种。由于本发明的方法是在量子点表面修饰叠氮基，并利用叠氮基与环炔基发生点击化学反应，而点击化学反应与量子点本身并无直接关系。因此，本领域技术人员应理解，本发明的方法理论上适用于所有荧光量子点，其中核壳型的量子点具有更加稳定的光学性质。

根据本发明一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法的一个实施例，所述细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液制备完成后，加入ph为7.2-7.6的缓冲液对其洗涤，将多余的点击化学修饰连接剂去除。

根据本发明一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法的一个实施例，所述荧光量子点标记的生物体培养液制备完成后，加入ph为7.2-7.6的缓冲液对其洗涤，将多余的叠氮-荧光量子点复合物去除，并采用离心的方式收集荧光量子点标记的细胞。

根据本发明一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法的一个实施例，所述缓冲液为pbs缓冲液或者hepes缓冲液。

根据本发明一种纳米量子点对动物细胞的荧光标记方法的一个实施例，所述培养液为dmem培养液。

图2为本发明的叠氮-量子点复合物结构示意图。从图中可见，本发明所用的量子点内核为cdse/zns核壳型量子点，经叠氮基修饰后，量子点表面包覆一层带叠氮基的聚合物，叠氮基暴露于外，可以与环炔基化合物发生点击化学反应。

实际操作中，细胞可以经一段时间的培养。例如，使用含10%小牛血清的dmem培养基，在37℃、5%co2/95%空气、饱和湿度的培养条件下培养。隔天更换培养液，每4~6天传代一次。使用前，首先用缓冲液将细胞洗3次，并换新鲜的不含小牛血清的dmem培养基。

细胞表面虽然有多个氨基，但是通过与点击化学修饰连接剂分子连接后，转变为环炔基，转变的数量和加入的修饰试剂分子有关系，环炔基可以与量子点表面的叠氮基团发生连接反应。每个量子点表面有多个叠氮基，原理上每个叠氮基团都可以连接一个点击化学修饰连接剂分子，由于量子点只有10nm左右大小，可以通过控制点击化学修饰连接剂分子与细胞的比例，来保证细胞表面量子点能接触到的范围内，仅有一个环炔基能够与量子点表面的叠氮基反应。生物体系中通常不含有环炔基和叠氮基，如此，整个反应体系只有含有环炔基的细胞能和带有叠氮基的量子点反应，从而，本发明的标记方法具有明显的特异性。

对于相对复杂的生物体系如血液、人体组织等体系中，采用这种标记方法可以大大避免传统基于氨基和羧基反应的非特异性标记带来的伪信号。同时相对生物素-亲和素方法由于是化学键合，因此标记产物更加稳定。

由于本发明的生物体荧光标记是基于对细胞进行的荧光标记，因此，本发明的方法可以对细胞、干细胞、病毒、细菌等生物体进行荧光量子点标记。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

原料与试剂

n3-pmah聚合物修饰剂：参照文献

journaloftheamericanchemicalsociety2012134(20),8388-8391中所公开的方法合成。具体地，将聚马来酸酐（分子量1000，购自polysciences,inc）、组胺（购自西格玛奥德里奇公司）、叠氮基团末端的氨基化聚乙二醇n3-peg8-ch2ch2nh2（购自嘉兴博美生物技术有限公司）在二甲基亚砜（购自西格玛奥德里奇公司）中反应12小时得到。其1hnmr图谱示于图3。

cdse/zns核壳量子点：购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。

a549肺癌细胞、ramos淋巴瘤细胞：均从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心获得。

叠氮-量子点复合物

本发明所用的量子点内核为cdse/zns核壳型量子点，外面包裹修饰有叠氮基团聚马来酸酐聚合物n3-pmah。其制备方法如下：

将cdse/zns核壳量子点溶解于氯仿中，然后将聚合物n3-pmah溶解于二甲基亚砜，缓慢加入cdse/zns核壳量子点的氯仿溶液。形成透明溶液。50℃加热2h，用旋转蒸发除去氯仿，再在90℃加热4h。降温后，加入氯仿/正己烷=1：1沉淀，6000g离心10min。丙酮洗3次。重新溶解于ph为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，即得到叠氮-量子点复合物溶液。

图4为本发明所用叠氮-量子点复合物的吸收和发射光谱。从图中可见，本发明的叠氮-量子点复合物在300nm到590nm有连续的吸收光谱，而发射波长在600nm附近。也就是说用300nm到590nm之间任何波长的光源激发都可以将其激发而发射出600nm的红色荧光。这对于细胞的荧光标记而言，为荧光成像激发光的选择带来极大的方便。

图5示出本发明实施例中所用叠氮-量子点复合物的透射电镜图像。从图中可见，本发明的量子点粒径小于5nm，和一般的生物分子如蛋白质大小基本差异不大，不会影响细胞的自身功能。同时也能确保细胞表面只有1个环炔基能与量子点结合。

尽管本发明并未穷举，而仅使用了cdse/zns量子点作为叠氮-量子点复合物的内核，应理解，本发明的方法适用于所有的荧光量子点，包括cdse、cdte、cds、zns、cuinse、cuins、inp等量子点，或是cdse/zns、cdte/cds、cdte/cdse等的核壳型量子点，以及它们的任意组合。

实验1：a549肺癌细胞标记

a549肺癌细胞培养：培养液为含10%小牛血清的dmem培养基，培养条件：37℃，5%co2/95%空气，饱和湿度，隔天更换培养液，每4~6天传代一次。

a549肺癌细胞培养：培养液为含10%小牛血清的dmem培养基，培养条件：37℃，5%co2/95%空气，饱和湿度，隔天更换培养液，每4~6天传代一次。

a549肺癌细胞与点击化学修饰连接剂的结合：首先用pbs缓冲液将细胞洗3次，换新鲜的不含小牛血清的dmem培养基，然后将摩尔量为细胞摩尔量10倍的点击化学修饰连接剂dbco-peg4-nhsester加入细胞培养液，在室温下振荡反应30分钟，然后用pbs缓冲液洗去多余的修饰试剂，加入新鲜的培养基，备用。

用叠氮-量子点复合物对a549肺癌细胞进行荧光标记：将摩尔量为细胞摩尔量10倍的叠氮-量子点复合物加入以上步骤得到的细胞培养液中，孵育30分钟，用pbs缓冲液洗去多余的叠氮-量子点，得到量子点标记的细胞溶液。

这样的用量是为了保证修饰试剂和量子点在一定范围内过量，以提高标记效率。

用荧光显微镜可以观察到细胞上有明显的荧光信号，如图6a所示。细胞采用明场模式观察，得到的细胞图象为黑白；而量子点发出的荧光信号采用488nm的激光激发，收集590nm到630nm波长范围的红色荧光信号。可以看到量子点的红色荧光信号和细胞得到很好的重叠。说明细胞已经成功得到标记。

实验2：ramos淋巴瘤细胞标记

ramos淋巴瘤细胞培养：培养液为含12%胎牛血清的dmem培养基，培养条件：37℃，5%co2/95%空气，饱和湿度，隔天更换培养液，每4~6天传代一次。

ramos淋巴瘤细胞与点击化学修饰连接剂的结合：首先用pbs缓冲液将细胞洗3次，离心收集细胞，换新鲜的不含小牛血清的dmem培养基，然后将摩尔量为细胞摩尔量30倍的点击化学修饰连接剂加入细胞培养液，反应30分钟，然后用pbs缓冲液洗去多余的修饰试剂，加入新鲜的培养基，备用。

用叠氮-量子点复合物对ramos淋巴瘤细胞进行荧光标记：将摩尔量为细胞摩尔量30倍的叠氮-量子点复合物加入第二步得到的细胞培养液中，孵育30分钟，用pbs洗去多余的叠氮-量子点，离心收集得到量子点标记的细胞溶液。

这样的用量是为了保证修饰试剂和量子点在一定范围内过量，以提高起标记效率。由于ramos淋巴瘤细胞是悬浮细胞，为保证其标记效率，修饰剂和量子点的用量会比前面的细胞用量多。

应理解，根据本发明的方法，针对不同的细胞，或为适应不同的情况，点击化学修饰连接剂及叠氮-量子点复合物的用量可以在细胞摩尔量10-100倍范围内变化，并可由本领域技术人员根据实际情况进行选择和调整。

用荧光显微镜可以观察到细胞上有明显的荧光信号，如图6b所示。细胞采用明场模式观察，得到的细胞图象为黑白；而量子点发出的荧光信号采用488nm的激光激发，收集590nm到630nm波长范围的红色荧光信号。可以看到量子点的红色荧光信号和细胞得到很好的重叠。说明细胞已经成功得到标记。

尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。