基于磁性分离和量子点标记的人流感嗜血杆菌快速检测方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测人 流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae,Hi)抗原的快速检测方法及检测试剂盒，以及该 检测试剂盒的制备及使用方法。
【背景技术】
[0002] 流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae,Hi)是感染人类的一种重要的呼吸道病 原微生物，该菌由波兰细菌学家费佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中发现的，在随 后的时间里被研究者们广泛研究。现仅知人是该病原体的宿主。免疫力较差的老人和儿童 为易感人群，特别是5岁以下的婴幼儿。Hi可引发肺炎、结膜炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症 等，在全球每年至少有300万严重病例发生，可造成患儿致残甚至死亡。Hi分为有荚膜的a、 b、c、d、e、f共6个血清型和无荚膜的不可分型流感嗜血杆菌（nontypeableHaemophilus influenzae，NTHi)，一度以荚膜b型Hi最为流行。目前我国开展的Hi血清学检查大多也 只针对侵袭力较强的荚膜b型。而由于该型菌株荚膜多糖疫苗的成功研发与应用，其流行 已被有效控制。近来的研究多显示，在感染Hi的患者中最常见的菌株是NTHi，其分离率已 达50%以上。
[0003] 临床上由于Hi与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床 表现、X-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。婴幼儿疾病的特点是起病急、 转归快，因此敏感、快速、实用的Hi检测对及早进行有效的临床干预具有非常重要的意义。
[0004] 尽管流感嗜血杆菌在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的 种类极少。目前，Hi感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检测法。检 测血清中HiIgG、IgA、IgM抗体常用的方法有：微量免疫荧光抗体检测（MIF)，补体结合试 验（CF)，重组酶免疫测定（rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验（SeroCF-EIA)等。然 而Hi抗体的检出只能说明该个体感染过Hi，却不能反映体内是否仍有Hi活菌存在，并且血 清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果进行判断，需要较长的时间。更重要 的是，血清学检测的主要检测对象为抗荚膜抗体，而NTHi由于没有荚膜，则会造成漏检。同 时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员操作、重复性差、检测时间长、 检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需要。
[0005] 核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应（PCR)，核酸杂交检测Hi的特异性强， 但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测；PCR具有较 高的敏感性，但PCR实验对实验室有特殊要求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现 假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。
[0006] 病原体检测方法主要为病原分离培养法，将标本接种于添加了V和X因子的巧克 力血琼脂培养基上，经24小时培养后，挑取可疑菌落经形态学鉴定后，用Hi鉴定卡、Vilek 一 60细菌自动分析系统鉴定到种，系统自动进行生物分型。但该法存在操作步骤复杂，细 胞培养时间长等明显缺陷，并不适合临床应用。更重要的是，其中的荚膜肿胀实验等仅限于 对有荚膜的菌株进行鉴定，而无荚膜型（NTHi)则全部漏检。
[0007] 因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的人流感嗜血杆菌抗原快速检测法以满足 临床的检测需求就显得非常必要了。
【发明内容】
[0008] 针对【背景技术】中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点 标记的能简便、快速、高灵敏度的检测人流感嗜血杆菌抗原的检测方法和试剂盒，以及该试 剂盒的制备及使用方法。
[0009] 本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0010] -种基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的方法，其特征在 于：所述方法包括以下步骤：
[0011] 1)兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体的制备；
[0012] 2)鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体的制备；
[0013] 3)将步骤1)制备得到的兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体与纳米磁珠通 过共价偶联，制备抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠；
[0014] 4)将步骤2)制备得到的鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体与纳米量子点 通过共价偶联，制备量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针；
[0015] 5)取人呼吸道分泌物样本（包括但不限于咽拭子），用PBST缓冲液溶解后，加入 步骤3)制备得到的抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠，充分混合，反应10-45min后进行磁分 离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，向磁分离得到的沉淀物中加入步骤4)制备得到的量子点标 记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针，反应l〇_45min后进行磁分离，以上述PBST缓冲液洗涤2 遍后，使用荧光酶标仪读取荧光值；所述PBST缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/ LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.3g/LNaN3,0.5ml/LTween-20;所述PBST缓冲 液的pH= 7. 4 ;
[0016] 6)根据步骤1)-步骤5)的方法分别检测四份经临床确定为人流感嗜血杆菌阴性 的人群的呼吸道分泌物样品，读取荧光值；所述人流感嗜血杆菌阴性的人群的呼吸道分泌 物样品简称人流感嗜血杆菌阴性对照样品；所述四份人流感嗜血杆菌阴性对照样品的荧光 值的平均值与3倍标准差之和即为⑶T-OFF值；若步骤5)中人呼吸道分泌物样本的检测荧 光值大于CUT-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人流感嗜血杆菌抗原为阳性；若步 骤5)中人呼吸道分泌物样本的检测荧光值小于⑶T-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本 中人流感嗜血杆菌抗原为阴性。
[0017] -种基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的试剂盒，其特征在 于：所述试剂盒由具有富集人流感嗜血杆菌抗原功能的抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠、 量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针、质控品以及PBST缓冲液所组成；所述质控品包 括阳性质控品以及阴性质控品；所述阳性质控品由灭活的人流感嗜血杆菌干燥结合到拭子 上而成；所述阴性质控品是经临床确定为人流感嗜血杆菌阴性的人群的咽拭子。
[0018] -种用于制备基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的试剂盒 的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
[0019] 1)抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠的制备：
[0020] I. 1)兔及鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG的制备
[0021] I.I. 1)重组P6_His融合蛋白的制备、纯化：
[0022] I.I.I. 1)对人流感嗜血杆菌膜蛋白P6进行生物信息学分析，获取其胞外保守结 构域中抗原表位最为丰富的肽段；
[0023]I.I. 1. 2)找到步骤I.I.I. 1)中所得到肽段对应的基因编码序列，在上述基因序 列的5'端及3'端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记记为P6;其基因序列如 序列表所示；
[0024]I.I. 1. 3)将步骤I.I. 1. 2)中所得到的P6按分子生物学方法克隆入表达载体 pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P6-His融合蛋白；所述重组P6-His融合蛋白以可 溶性表达方式存在于菌体中；
[0025] I.I. 1. 4)用镍柱纯化步骤I.I. 1. 3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后， 以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0. 2mg/mL后备用；
[0026]I. 1. 2)兔及鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG的制备：
[0027]I. 1. 2. 1)以步骤I.I. 1. 4)中所得到的重组P6_His融合蛋白为完全抗原，分别免 疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6抗血清及鼠抗人流感嗜 血杆菌膜蛋白P6抗血清；所述兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6抗血清及鼠抗人流感嗜血杆 菌膜蛋白P6抗血清的间接ELISA效价均大于IXIO5 ;
[0028]I. 1. 2. 2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6抗 血清及鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6抗血清中的多克隆抗体IgG;
[0029]I. 1. 2. 3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤I. 1. 2. 2)所得到的二种 多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为lmg/mL后备用；
[0030] 1. 2)免疫纳米磁珠的包被：
[0031] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用ImlMES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离 后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为350nm的羧基磁珠；所述MES缓 冲液是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代）乙磺酸；所述MES缓冲液的pH= 6. 0 ;所述纳米 磁分离器的磁性强度是〇. 4T;
[0032]L2. 2)依次加入用步骤L2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋转混合仪中活化lhr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除 上清，用Iml步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；
[0033] 1.2. 3)取5个离心管，在每个离心管中加入200iiL步骤1.2. 2)所得到的活化 后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBS缓冲液 稀释的浓度为50-200iig/ml的由步骤I. 1)所制备的兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克 隆抗体IgG溶液各lml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2-6h，置于纳米磁分离 器中进行磁分离后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以 15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中 各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4，所述PBS缓冲 液的pH= 7. 4 ;
[0034]I. 2. 4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移 除上清，各用Iml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.5ml/LTween-20,所述洗涤缓冲液的pH= 7.4 ；
[0035]I. 2. 5)向各个离心管中分别加入Iml保存缓冲液重悬磁珠，置于4°C保存备用； 所述保存缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0. 3g/LNaN3, 5g/L牛血清白蛋白（BSA)，所述保存缓冲液的pH= 7. 4 ;
[0036] 2)量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针的制备：
[0037] 其具体制备方法包括：
[0038] 2. 1)向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmolN-羟基琥珀酰 亚胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，混合溶液，37°C反 应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS及E：DC，得到活化后的量子点；所述 磷酸盐缓冲液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氢二钠，0. 295g/L磷酸二