基于磁性分离和量子点标记的人a群链球菌快速检测方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测人 A群链球菌（groupAstreptococci,GAS) (111，3,5,6,24血清型）抗原的快速检测方法及 检测试剂盒，以及该检测试剂盒的制备及使用方法。
【背景技术】
[0002] 链球菌广泛分布于自然界和动物体内，可长期寄居于人体鼻咽部和肠道中。为革 兰氏阳性菌，呈球状或卵圆形，为需氧或兼性厌氧菌，对营养要求较高。链球菌种类繁多，根 据溶血能力分为a、P、Y溶血性链球菌，又称之甲型、乙型、丙型溶血性链球菌。根据链球 菌胞壁所含多糖（C抗原）的不同分为A~V等20族（其中缺I和J)，（Lancefield分型）。 对人类有致病性的链球菌90%属于A群。链球菌C抗原的外层还具有M、T、R、S4种型特 异性抗原。M抗原主要见于A群，根据M抗原的不同又可分为90多个血清型，其中在我国能 引起风湿热的临床上最常见的血清型为組，10』5，116，1118，1124等。八群链球菌&仰即八 streptococci,GAS)又称化脓性链球菌（streptococcuspyogenes)，为0溶血性链球菌。 A群链球菌感染和后遗症一直是困扰公共健康和国民经济的严重问题，尤对儿童和青年影 响最大。A群链球菌感染最常发生于冬春季和雨季，在儿童发病年龄多见于5~15岁，临床 可把A群链球菌感染分为四类：①浅表部位感染：咽炎、皮肤和软组织感染、脓疱疮、丹毒、 阴道炎、产后感染；②深部感染：菌血症、坏死性筋膜炎、深部组织感染、蜂窝织炎、肌炎、脓 毒败血症、心包炎、脑膜炎、肺炎、化脓性关节炎；③毒素介导：猩红热、链球菌中毒性休克 综合征；④免疫介导：风湿热、链球菌感染后肾小球肾炎、反应性关节炎。
[0003] 临床病人由于不同的呼吸道病原体（如副流感病毒、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等）感染引起疾病症状可以十分相似，这导致了流行诊断比较困难， 确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明 确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。
[0004] 尽管A群链球菌在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种 类极少。目前，A群链球菌的检测主要有以下几种方法：
[0005] 一、常规实验室检测
[0006] 1、细菌分离
[0007] 细菌培养是诊断A群链球菌感染的"金标准"。样本采集后最好立即接种到血琼脂 培养基上。若无条件及时接种，应使用转运培养基。将标本接种在血琼脂平皿，35~37°C， 含有5 %~10 %CO2或厌氧条件下孵育，可增加A群链球菌的分离率。血琼脂平皿孵育24~ 48h。A群链球菌菌落常不能与其他P-溶血性链球菌区别，特别是C群和G群，需采用血 清学方法进行最后鉴定。该法培养所需时间长，操作步骤繁多，且若采样前患者使用过抗菌 药物，会造成培养结果的假阳性。这样在临床方面对病人的治疗就有一定的局限性。
[0008] 2、血清学检测
[0009]即采用酶联免疫法、放免法、微量免疫荧光法等，检测被检者血清中A群链球菌抗 体水平，可间接提示A群链球菌感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊 断，它需要同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期中抗人A群链球菌抗体 效价比急性期高4倍或4倍以上才有诊断意义。另外，临床上主要检测的抗体为抗链球菌 素0,而统计学研究表明大约20%的病人并不出现出现抗链球菌素0水平的升高，故现有血 清学方法的检测质量受到一定限制。
[0010] 二、快速诊断
[0011] 直接检查人A群链球菌蛋白抗原和菌体核酸可达到快速诊断的目的，目前主要有 免疫荧光法、免疫酶法和PCR法等。免疫荧光法和免疫酶法均不能进行一步检测，均存在操 作步骤复杂，需要专业人员操作，检测时间长（2h以上），成本较高等缺点。PCR法主要是检 测链球菌特异性rRNA序列，其检测快速、灵敏、特异，是目前研究A群链球菌感染的重要手 段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的 临床诊断方法。目前，检测人A群链球菌抗原的方法主要为胶体金法检测其C多糖抗原，但 是胶体金法敏感度较低，对样品材料质量要求较高，同时在检测前还必须对样品进行细胞 裂解以释放C多糖，而添加细胞裂解液的量又对检测灵敏度有较大的影响。因此，建立具备 高灵敏度的A群链球菌特异性抗原快速诊断法十分必要。
【发明内容】
[0012] 针对【背景技术】中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点 标记的能简便、快速、高灵敏度的检测人A群链球菌（Ml，3,5,6,24血清型）抗原的检测方 法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。
[0013] 本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0014] -种基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌（Ml，3,5,6,24血清型）抗 原的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
[0015] 1)兔抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗体的制备；
[0016] 2)鼠抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗体的制备；
[0017] 3)将步骤1)制备得到的兔抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗体与纳 米磁珠通过共价偶联，制备抗人A群链球菌免疫纳米磁珠；
[0018] 4)将步骤2)制备得到的鼠抗人A群链球菌1，3,5,6,24型11蛋白多克隆抗体与纳 米量子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针；
[0019] 5)取人呼吸道分泌物样本（包括但不限于咽拭子），用PBST缓冲液溶解后，加入 步骤3)制备得到的抗人A群链球菌免疫纳米磁珠，充分混合，反应10-45min后进行磁分 离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，向磁分离得到的沉淀物中加入步骤4)制备得到的量子点标 记的抗人A群链球菌纳米探针，反应10-45min后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，使 用荧光酶标仪读取荧光值；所述PBST缓冲液中各组分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/LKC1， 0? 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4,0? 3g/LNaN3,0? 5ml/LTween-20;所述PBST缓冲液的pH =7. 4 ;
[0020] 6)根据步骤1)-步骤5)的方法分别检测四份经临床确定为人A群链球菌（Ml，3， 5,6,24血清型）阴性的人群的呼吸道分泌物样品，读取荧光值；所述人A群链球菌（Ml，3， 5,6, 24血清型）阴性的人群的呼吸道分泌物样品简称人A群链球菌阴性对照样品；所述四 份人A群链球菌阴性对照样品的荧光值的平均值与3倍标准差之和即为CUT-OFF值；若步 骤5)中人呼吸道分泌物样本的检测荧光值大于⑶T-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本 中人A群链球菌（111，3,5,6,24血清型）抗原为阳性；若步骤5)中人呼吸道分泌物样本的 检测荧光值小于⑶T-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人A群链球菌（Ml，3, 5,6, 24 血清型）抗原为阴性。
[0021] -种基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌（Ml，3,5,6,24血清型）抗 原的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由具有富集人A群链球菌（M1，3, 5,6, 24血清型）抗 原功能的抗人A群链球菌免疫纳米磁珠、量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针、质控品以 及PBST缓冲液所组成；所述质控品包括阳性质控品以及阴性质控品；所述阳性质控品由灭 活的人Ml血清型A群链球菌干燥结合到拭子上而成；所述阴性质控品是经临床确定为人A 群链球菌（M1，3, 5,6, 24血清型）阴性的人群的咽拭子。
[0022] -种用于制备基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌（M1，3, 5,6, 24血 清型）抗原的试剂盒的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
[0023] 1)抗人A群链球菌免疫纳米磁珠的制备：
[0024] 1.1)兔及鼠抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗体IgG的制备
[0025] I.I. 1)重组M-His融合蛋白的制备、纯化：
[0026]I.I.I. 1)对人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白进行生物信息学分析，分别获取 其N端型特异性序列（高变区）中含胞外抗原表位且不与其他抗原抗体起交叉反应的的肽 段；
[0027]I.I. 1. 2)找到步骤I.I.I. 1)中所得到五个肽段一一对应的基因编码序列，按 M1-M3-M5-M6-M24的顺序进行序列拼接并根据大肠杆菌中密码子的偏好性对该序列进行密 码子优化，在上述经密码子优化后的重组基因的序列的5'端及3'端引入酶切位点并化学 合成全基因序列，同时标记记为m;其基因序列参见序列表；
[0028]I. 1. 1.3)将步骤I. 1. 1.2)中所得到的m按分子生物学方法克隆入表达载体 pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组M-His融合蛋白；所述重组M-His融合蛋白以可溶 性表达方式存在于菌体中；
[0029]I.I. 1. 4)用镍柱纯化步骤I.I. 1. 3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后， 以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0. 2mg/mL后备用；
[0030]I. 1. 2)兔及鼠抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗体IgG的制备：
[0031]I. 1. 2. 1)以步骤I.I. 1. 4)中所得到的重组M-His融合蛋白为完全抗原，分别免疫 新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清及鼠抗人A 群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清；所述兔抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血 清及鼠抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于IXIO5 ;所述 间接ELISA是重组M-His融合蛋白作为包被抗原为基础；
[0032]I. 1. 2. 2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型 M蛋白抗血清及鼠抗人A群链球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG;
[0033]I. 1. 2. 3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤I. 1. 2. 2)所得到的多克 隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为lmg/mL后备用；
[0034]I. 2)免疫纳米磁珠的包被：
[0035] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用ImlMES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离 后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为350nm的羧基磁珠；所述MES缓 冲液是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代）乙磺酸；所述MES缓冲液的pH= 6. 0 ;所述纳米 磁分离器的磁性强度是〇. 4T;
[0036]L2. 2)依次加入用步骤L2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋转混合仪中活化lhr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除 上清，用Iml步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；
[0037] 1. 2. 3)取5个离心管，在每个离心管中加入200iiL步骤1. 2. 2)所得到的活化后 的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀 释的浓度为50-300iig/ml的由步骤I. 1)所制备的兔抗人A群链球菌1，3,5,6,24型M蛋 白多克隆抗体IgG溶液各lml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2-6h，置于纳米磁 分离器中进行磁分离后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温 下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲 液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4，所述PBS 缓冲液的pH= 7. 4 ;
[0038]I. 2. 4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移 除上清，各用Iml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.2