引入酶切位点并化学 合成全基因序列，同时标记记为m; I. 1. 1.3)将步骤I. 1. 1.2)中所得到的m按分子生物学方法克隆入表达载体 pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组M-His融合蛋白；所述重组M-His融合蛋白以可溶 性表达方式存在于菌体中； I.I. 1. 4)用镍柱纯化步骤I.I. 1. 3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，以 Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0. 2mg/mL后备用； 1. 1. 2)兔及鼠抗人A群链球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗体IgG的制备： 1. 1.2. 1)以步骤I. 1. 1.4)中所得到的重组M-His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新西 兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人A群链球菌1，3,5,6,24型11蛋白抗血清及鼠抗人4群链 球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清；所述兔抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清及 鼠抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于IXIO5 ;所述间接 ELISA是重组M-His融合蛋白作为包被抗原为基础； I. 1. 2. 2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋 白抗血清及鼠抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG; I. 1. 2. 3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤I. 1. 2. 2)所得到的多克隆抗 体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为lmg/mL后备用； 1. 2)免疫纳米磁珠的包被： 1. 2. 1)取5mg磁珠，用ImlMES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移 除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为350nm的羧基磁珠；所述MES缓冲液 是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代）乙磺酸；所述MES缓冲液的pH= 6. 0 ;所述纳米磁分 离器的磁性强度是0. 4T; 1. 2. 2)依次加入用步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的EDC溶液 以及用步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各0. 5ml， 以10-40rpm/min于旋转混合仪中活化lhr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清， 用Iml步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠； 1. 2. 3)取5个离心管，在每个离心管中加入200yL步骤1. 2. 2)所得到的活化后的磁 珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的 浓度为50-300iig/ml的由步骤I. 1)所制备的兔抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多 克隆抗体IgG溶液各lml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2-6h，置于纳米磁分离 器中进行磁分离后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以 15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中 各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4，所述PBS缓冲 液的pH= 7. 4 ; 1. 2. 4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上 清，各用Iml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/L KCl，0? 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4,0? 5ml/LTween-20,所述洗涤缓冲液的pH= 7. 4 ; I. 2. 5)向各个离心管中分别加入Iml保存缓冲液重悬磁珠，置于4°C保存备用；所述 保存缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，a24g/LKH2P04，L44g/LNa2HPO4, 0. 3g/LNaN3, 5g/L牛血清白蛋白，所述保存缓冲液的pH= 7. 4 ; 2)量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针的制备： 其具体制备方法包括： 2. 1)向微量离心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子点、600nmolN-羟基琥珀酰亚 胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，混合溶液，37°C反应 30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS及EDC，得到活化后的量子点；所述磷酸 盐缓冲液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氢二钠，0. 295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠；所述 磷酸盐缓冲液的pH= 7. 4 ; 2. 2)在步骤2. 1)所得到的活化的量子点中，加入4-16nmol的步骤I. 1)中所制备的鼠 抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入单端氨基化聚乙 二醇PEG2000-NH2至终浓度为1%，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应Ih; 2.3)用0.2pmPES滤器过滤除去步骤2. 2)中的抗体聚集物，然后将滤液转移到 50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和 反应中的副产物； 2. 4)收集步骤2. 3)中超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐 洗涤液中，再将此溶液转移到一个新的50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离 心15min，收集超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于Iml磷酸盐保存液中，置 于4°C保存备用；所述磷酸盐洗涤液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氢二钠，0. 295g/L磷酸 二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温-20,0. 3g/L叠氮钠，所述磷酸盐洗涤液的pH= 7. 4 ;所述 磷酸盐保存液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氢二钠，0. 295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠， 10g/L牛血清白蛋白，0. 3g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH= 7. 4 ; 3. PBST缓冲液的配制： 其具体配制方法包括： 取 8g NaCL，0.2g KCl，0.24KH2P04，1. 44g Na2HPO4,0.3g NaN3,0.5ml Tween-20 溶解于 800ml蒸馏水中，用5M NaOH调整pH至7. 4,再定容至1000ml ; 4) 质控品的制备： 4. 1)阳性质控品：阳性质控品由灭活的人Ml型A群链球菌干燥结合到拭子上而成； 4.2)阴性质控品：阴性质控品即经临床确定为人A群链球菌阴性的人群的咽拭子；所 述人A群链球菌是人A群链球菌Ml，3, 5,6, 24血清型。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1.2. 2)中，依次加入用步骤 1. 2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是lOmg/ml的EDC溶液以及用步骤1. 2. 1)中的MES缓 冲液配制的浓度是lOmg/ml的sulfo-NHS溶液各0. 5ml，以15rpm/min于旋转混合仪中活 化lhr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用Iml步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液重 悬，得到活化后的磁珠； 所述步骤1. 2. 3)中，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为240iig/ml的由 步骤I. 1)所制备的兔抗人A群链球菌1，3,5,6,24型11蛋白多克隆抗体186溶液各11111， 室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应3h，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清 后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液； 所述步骤2. 2)中，在步骤2. 1)所得到的活化的量子点中，加入12nmol的步骤I. 1)中 所制备的鼠抗人A群链球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h。5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述量子点是羧基化两亲聚合物修 饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述磁珠是以超顺磁性Fe304为内核、壳 材料为聚苯乙烯、表面官能团为羧基、粒径为350nm的羧基磁珠。7. -种基于如权利要求2所述的基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌抗原 的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述使用方法包括以下步骤： 1) 将待检样本用〇. 5mlPBST缓冲液溶解后将溶解液转入I. 5ml普通离心管中；所述 PBST缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HPO4, 0? 3g/LNaN3,0. 5ml/LTween-20 ;所述PBST缓冲液的pH= 7. 4 ; 2) 向步骤I)中的离心管中加入基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌抗原 的试剂盒中的抗人A群链球菌免疫纳米磁珠100-30011 1，室温下以10rpm/min于旋转混合 仪上反应l〇-45min后取下，将离心管插入纳米磁分离器磁分离3min，用移液器吸出上清； 3) 添加试剂盒中的PBST缓冲液Iml洗涤两遍，采用纳米磁分离器磁分离后吸出洗涤 液，最后用ImlPBS缓冲液重悬磁珠，制得免疫纳米磁珠-菌体抗原复合物；所述PBS缓冲 液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HPO4;所述PBS 缓冲液的pH= 7. 4 ; 4) 取100ill步骤3)得到的免疫纳米磁珠-菌体抗原复合物于另一离心管中，再加入 100Pl基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌抗原的试剂盒中的量子点标记的 抗人A群链球菌纳米探针，室温下以15rpm/min于旋转混合仪上反应10-45min，通过量子点 上的抗体与免疫纳米磁珠上的菌体抗原的免疫结合，量子点被标记到菌体抗原表面，形成 磁珠-菌体抗原-量子点"三明治"复合物； 5) 反应完成后，采用纳米磁分离器磁分离3min，除去多余的量子点标记的抗人A群链 球菌纳米探针，用试剂盒中的PBST缓冲液液清洗2遍，复合物重新分散在100illPBS缓 冲液中，使用荧光酶标仪对其荧光值进行检测；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0. 2g/LKC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4 ;所述PBS缓冲液的pH= 7. 4 ; 6) 按上述同样的方法检测试剂盒中提供的四份阴性质控品样品及一份阳性质控品 样品，分别读取荧光值；四份阴性质控品样品的荧光读数的平均值与3倍标准差之和即为 CUT-OFF值；若步骤5)中待检样本的检测荧光值若大于CUT-OFF值即判断为待检样本中人 A群链球菌抗原为阳性，反之则判断为待检样本中人A群链球菌抗原为阴性；若阳性质控品 样品的荧光值小于CUT-OFF值，则表明试剂盒失效； 所述人A群链球菌是人A群链球菌Ml，3, 5,6, 24血清型。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，向步骤1)中的离心管中 加入基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌抗原的试剂盒中的抗人A群链球菌免 疫纳米磁珠200ii1，室温下以10rpm/min于旋转混合仪上反应20min后取下，将离心管插入 磁力架分离3min，用移液器吸出上清； 所述步骤4)中，取100ill步骤3)得到的免疫纳米磁珠-菌体抗原复合物于另一离心 管中，再加入IOOu1基于磁性分离和量子点标记的检测人Ml，3, 5,6, 24A群链球菌抗原的 试剂盒中的量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针,室温下以15rpm/min于旋转混合仪上 反应20min,通过量子点上的抗体与免疫纳米磁珠上的菌体抗原的免疫结合,量子点被标记 到菌体抗原表面，形成磁珠-菌体抗原-量子点"三明治"复合物。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述待检样本包括但不限于咽拭子。
【专利摘要】本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌抗原的方法，该方法包括（1）制备抗人A群链球菌免疫纳米磁珠；（2）制备量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针；（3）将待检样品用PBST缓冲液溶解后，向溶解液中加入抗人A群链球菌免疫纳米磁珠，充分混合及反应后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤，向得到的沉淀物中加入量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针，反应后磁分离，以PBST缓冲液洗涤后，使用荧光酶标仪检测荧光值。本发明具有准确、快速、高灵敏度的检测人A群链球菌的方法，其在人M1，3，5，6，24血清型A群链球菌的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN105223351
【申请号】CN201410404768
【发明人】胡征, 杨波, 董俊
【申请人】董俊
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年8月18日