用于检测酿脓链球菌的lamp试剂盒及其专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及细菌的分子生物学，特别是设及一种酿脈链球菌 的LAMP试剂盒及其专用引物与其在检测酿脈链球菌中的应用。
【背景技术】
[0002] 酿脈链球菌临床感染及治疗现状
[0003] 酿脈链球菌（Streptococ州S pyogenes)，即 A群链球菌（Group A streptococ州S， GAS,是根据抗原构造不同定义为A群），e溶血（是指能够完全使绵羊血细胞琼脂溶血）， 是人体的重要致病菌之一，可W引起很多种疾病，引起的感染性疾病主要有急性咽炎、急性 扁桃体炎，也可致肺部感染、猩红热、皮肤软组织感染，并可致全身性感染。酿脈链球菌也是 引起变态反应性疾病风湿热和急性肾小球肾炎的间接原因。近年来，A群链球菌常引起严 重的感染，由侵袭性A群链球菌（invasive group A str巧tococ州S infections)引发的 疾病的发病率增长，使人们对该类细菌感染更加关注。
[0004] 酿脈链球菌可侵袭任何年龄的人，但发病者多为儿童。正常人鼻咽部、皮肤可带 菌，并有由肛n、阴道带菌引起暴发流行的报告。呼吸道与直接接触均可传播。亦有进食被 污染食物引起咽峡炎暴发的报道。生活贫困、卫生条件差、居住拥挤、密切接触等均有助于 酿脈链球菌感染的发生。
[0005] 目前，酿脈链球菌感染的治疗药物首选青霉素，但应考虑到可能有耐药菌株，应加 大剂量或改用它药，如红霉素、克林霉素、第一代、二代头抱类抗生素等。最好参照当地药敏 结果选用。
[0006] 检测酿脈链球菌的方法主要是传统的培养鉴定、血清学分析等，存在耗时和结果 不易判定等缺点。因此，快速、准确检测病原菌，予W规范合理的抗生素治疗，是控制酿脈链 球菌感染的有效措施。
[0007] LAMP技术介绍
[0008] 环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 由 Notomi(Notomi T，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000:28(12) :63.)发明的一种新型基因扩增技术。具体方法是针对祀基因 值NA或者cDNA)的6个区域，设计4-6种特异引物，利用链置换DNA聚合酶，在等温条件下 可W高效、快速、高特异地扩增祀序列，结果直接靠扩增副产物焦磯酸儀的沉淀浊度进行判 断。LAMP技术具有快速高效、特异性强、灵敏度高、操作简单、检测直观和设备要求低等特 点。
[0009] 自2000年发明W来，LAMP技术已被迅速用于病原微生物检测、遗传病诊断、 食品安全等领域的分子生物学检测领域。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体 检测J。Masaki Imai 等人（Imai M，Ninomiya A, Minekawa H，et al. Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza HShemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods. 2007 ; 141(2) : 173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体 系；Nobuyuki Hayashi 等人化ayashi N，Arai R，Tada S，Taguchi H, Ogawa Y. Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp. yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method.化〇(1 Microbiol. 2007 ;24(7-8):778-85.)针对四种 香酒酵母的ITS序列设计了 LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可W 检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病（V服)、巨细胞病毒（CMV)、埃博拉病 毒巧B0V)、慢性伯基特淋己瘤病毒巧BV)、虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒 (工HHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。目前，国内外均未见有用于检测酿脈链球 菌的LAMP试剂盒及其专用引物。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了用于对酿脈链球菌进行LAMP检测的引物，W实现酿脈链球菌的批 量检测，提高检测的特异性和灵敏度。
[0011] 本发明所提供的用于检测酿脈链球菌的LAMP引物，是根据酿脈链球菌转录调控 基因（the putative transcriptional regulator gene) spyl258 的特异性保守勒1序列设 计的，用W定性检测纯菌、疲液、脑脊液及其它分泌物等样品中的酿脈链球菌，所述LAMP引 物由五条引物组成，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、化及环引物LF的组合；所述酿 脈链球菌转录调控基因spyl258的特异性保守祀序列如序列表中SEQ ID NO ;1所示。
[0012] 具体来讲，所述用于对酿脈链球菌进行LAMP检测的五条引物的核巧酸序列如序 列表中 SEQ ID N0;2(F3)、SEQ ID N0;3 炬3)、SEQ ID N0;4(FIP)、SEQ ID N0;5 炬I巧和 SEQ ID NO ;6 (L巧所示。
[0013] 所述的LAMP引物，为FIP和BIP、F3和B3、W及LF按摩尔比 40:5:20 的组合物。
[0014] 本发明的第二个目的是提供一种用于对酿脈链球菌进行LAMP检测的试剂盒。
[0015] 本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对酿脈链球菌进行LAMP检测的引物。
[0016] 具体来讲，所述试剂盒包括W下用于25 y 1反应体系的试剂；20mM Tris ?肥1(抑8. 8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,〇. 1% Tween20,0. 8M 甜菜碱（betaine)，8mM M拆〇4，1.4mM dNTP each, 8U Bst DM polymerase,引物加入量为；40pmol 引物 FIP 和 BIP， 5pmol 引物 F3 和 B3,20pmol 引物 LF。
[0017] 为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为酿脈 链球菌标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水。
[001引上述LAMP引物或试剂盒在酿脈链球菌LAMP检测中的应用也属于本发明的保护范 围。
[0019] 本发明的第S个目的是提供一种酿脈链球菌的LAMP检测方法。
[0020] 本发明所提供检测方法，可包括W下步骤：
[002U 1) W待测样品基因组DM为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增，25 LAMP反应体系包括：待测样品基因组DM 2yl，20mM Tris ?肥1(抑8. 8)，10mM KC1， 10mM(NH4)2S04,0. l%Tween20,0. 8M 甜菜碱化etaine)，8mM MgS04，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase,引物加入量为；40pmol 引物 FIP 和 BIP，5pmol 引物 F3 和 B3,20pmol 引物 LF ;LAMP扩增条件为；置60-65°C恒温45-55min ;
[0022] 2)反应结束后进行结果判定；在反应液中添加巧黄绿素指示剂，根据反应液的颜 色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在酿脈链球菌，澄色表示待测样品中不存在酿脈 链球菌；或者不添加巧黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断 结果，浊度上升表示待测样品中存在酿脈链球菌，浊度无变化表示待测样品中不存在酿脈 链球菌。
[0023] 在上述检测方法中，所述步骤1)中的LAMP反应体系中还设有阳性对照和阴性对 照，所述阳性对照为酿脈链球菌标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体 系，如双蒸水；所述LAMP扩增条件优选为：置63°C恒温50min。
[0024] 所述步骤2)中巧黄绿素指示剂的添加量可为1 y 1 (终反应体系为26 y 1)，含有 0. 5mM巧黄绿素和lOmM氯化车孟。
[0025] 本发明提供了一种酿脈链球菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明 检测的酿脈链球菌原理是采用LAMP技术，对酿脈链球菌转录调控基因spyl258的特异性保 守祀序列进行检测。spy