A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，旨在提供一种检测方法简单、快速，灵敏度高，检测结果可靠的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡；该检测试剂卡包括带盒盖的盒体(6)，盒体(6)内设有检测试纸，所述的盒体(6)的盒盖(61)上设有加样孔(71)和结果观察窗口(72)；所述的检测试纸包括底板(1)，底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、抗A族链球菌抗体量子点标记垫(3)、包被膜(4)和吸水垫(5)，所述的包被膜(4)上设有一条A族链球菌抗体检测区T线和一条羊抗兔多克隆抗体质控区C线，两条线平行排列；属于荧光免疫检测领域。
【专利说明】A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡 【技术领域】
[〇〇〇1] 本实用新型公开了一种检测试剂卡，具体地说，是一种测定咽部拭子中A族链球 菌的检测试剂卡，本实用新型还公开了该检测试剂卡的制备方法，属于荧光免疫检测领域。 【背景技术】
[0002] 小儿上呼吸道感染的常见病原体之一，在呼吸道感染患儿中A族链球菌阳性率约 为23. 2%。如不及时接受抗感染治疗，包括急性咽炎、脓胞病、中毒性休克综合征、侵袭性筋 膜炎、猩红热、肺炎、丹毒和A族链球菌感染后引起的变态反应性疾病，如急性风湿热、风湿 性心脏病、急性肾小球肾炎。目前普遍的A族链球菌鉴定方法主要有临床经验甄别、细菌培 养法。
[0003] 根据临床经验诊断A族链球菌的准确率偏低，据资料统计，即使经验丰富的医生 诊断的准确率也只有45% -75%。细菌培养法是A族链球菌诊断的"金标准"，该方法是将 采取的咽拭子接种于血琼脂平板上孵育24?48h，10% C02或厌氧条件下可增加 A族链球 菌的分离率，最终采取血清学方法鉴别A族链球菌与其他β溶血性链球菌，特别是C族和 G族，但是需要的时间较长。 实用新型内容
[0004] 针对上述不足，本实用新型的目的在于提供一种操作简单，诊断迅速，检测结果可 靠的Α族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡。
[0005] 为解决上述技术问题，本实用新型提供的技术方案是这样的：该A族链球菌量子 点免疫层析检测试剂卡，包括带盒盖的盒体，盒体内设有检测试纸，所述的盒体的盒盖上设 有加样孔和结果观察窗口；所述的检测试纸包括底板，底板上依次衔接有样品垫、抗A族链 球菌抗体量子点标记垫、包被膜和吸水垫，所述的包被膜上设有一条A族链球菌抗体检测 区T线和一条羊抗兔多克隆抗体质控区C线，两条线平行排列。
[0006] 上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，所述的包被膜两端分别与吸水垫 和抗A族链球菌抗体量子点标记垫相互交叠连接，在抗A族链球菌抗体量子点标记垫上压 贴有样品垫。
[0007] 进一步的，上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，所述的样品垫为玻璃 纤维样品垫。
[0008] 进一步的，上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，所述的包被膜为硝酸 纤维素膜。
[0009] 进一步的，上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，所述的抗A族链球菌抗 体量子点标记垫为包被量子点标记A族链球菌抗体聚酯纤维素膜。
[〇〇1〇] 更进一步的，上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，样品垫压在抗A族链 球菌抗体量子点标记垫的1/3?1/4处，抗A族链球菌抗体量子点标记垫压在包被膜的1_ 处，吸水垫压在包被膜1?2. 5_处，A族链球菌抗体检测区T线距离包被膜左端10_，羊 抗兔多克隆抗体质控区C线距离包被膜右端10mm，C、T线间距4?7mm。
[0011] 与现有技术相比，本实用新型所提供的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡具 有如下优点：
[0012] 本实用新型提供的技术方案，利用两种抗体的特异结合反应，形成特异的"三明 治"结构，即"抗体-抗原-抗体"免疫复合物，结合免疫层析技术，应用荧光免疫层析法检 测A族链球菌抗原，并与手持式紫外灯相配合，大幅度提高A族链球菌的检出率。
[0013] 本方法操作简单，诊断迅速，特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门的计时操作人 员，配合简单的仪器设备，即可得出结果。这样有利于医护人员抓住最佳治疗时间，避免抗 生素的滥用，同时降低A族链球菌变态反应的几率。 【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1是本实用新型提供的检测试剂卡结构示意图；
[0015] 图2是本实用新型提供的检测试剂卡的盒盖俯视图；
[0016] 图3是本实用新型提供的检测试纸结构示意图；
[〇〇17] 图4是本实用新型提供的检测试纸俯视图；
[0018] 图5是本实用新型提供的检测卡判定结果为阴性时示意图；
[〇〇19] 图6是本实用新型提供的检测卡判定结果为阳性时示意图。
[0020] 其中：底板1，样品垫2,抗A族链球菌抗体量子点标记垫3,包被膜4,吸水垫5, A 族链球菌抗体检测区T线，羊抗兔多克隆抗体质控区C线，盒体6,盒盖61，加样孔71，结果 观察窗口 72。 【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例的方式对本实用新型的权利要求做进一步的详细说明，但并 不构成对本实用新型的任何限制，任何人在本实用新型权利要求范围内所做的有限次的修 改，仍在本实用新型的权利要求范围之内。
[0022] 实施例1
[0023] 本实用新型提供的一种A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，参阅图1至图4， 所述的检测试剂卡包括带盒盖61的盒体6,为了方便加样和观察检测结果，所述的盒盖61 上设有加样孔71和结果观察窗口 72。
[0024] 盒体6内设有检测试纸，所述的检测试纸包括底板1，所述的底板1为PVC板，在底 板1上依次衔接有样品垫2、抗A族链球菌抗体量子点标记垫3、包被膜4和吸水垫5,在包 被膜4上设有一条A族链球菌抗体检测区T线和一条羊抗兔多克隆抗体质控区C线，两条 线平行排列。为了达到快速、准确的检测结果，所述的样品垫2优选玻璃纤维样品垫；所述 的包被膜4优选硝酸纤维素膜；所述的抗A族链球菌抗体量子点标记垫3为包被量子点标 记A族链球菌抗体聚酯纤维素膜。
[0025] 更具体的说，所述的包被膜4压贴在底板1中间部位，包被膜4的两端分别与吸水 垫5和抗A族链球菌抗体量子点标记垫3相互交叠连接，在抗A族链球菌抗体量子点标记 垫3上压贴有样品垫2。
[0026] 样品垫2压在抗A族链球菌抗体量子点标记垫3的1/3?1/4左右，抗A族链球 菌抗体量子点标记垫3压在包被膜4的1mm处，A族链球菌抗体检测区T线距离包被膜4左 端10mm，羊抗兔多克隆抗体质控区C线距离包被膜4右端10mm，C、T线间距4?7mm(优选 5mm)，吸水垫压在包被膜4的1?2. 5mm (优选2mm)处。
[0027] 该A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的制备方法：
[0028] 1)样品垫的制备方法是：将样品垫用含0· 5?5wt% BSA、0. 5?5wt%聚乙烯吡 咯烧酮、〇· 5?5wt%聚乙二醇、0· 1?5wt%吐温-20、1?5wt%曲拉通-100的0· 01M憐酸 盐缓冲液（〇. 01M磷酸氢二钠：0. 01M磷酸二氢钠=81:19(V :V)) (pH7. 4)浸泡完全后，37°C 烘干或在相对湿度< 35%的环境下干燥。
[0029] 缓冲液优选为0. 01M磷酸盐缓冲液中0. 5wt % BSA、0. 5wt %聚乙烯吡咯烷酮、 0· 5wt%聚乙二醇、0· 25wt%吐温-20、lwt% 曲拉通-100。
[0030] 2)抗A族链球菌抗体量子点标记垫的制备方法是：
[0031] ①用10mM pH8. 4的硼酸缓冲液（2. 5mM硼砂：10mM硼酸=4. 5:5. 5(V:V))将水溶 性羧基量子点8 μ Μ的QD525稀释至1 μ M。
[0032] ②取lmLlyM的量子点，加入30μ L10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亚胺盐酸溶液，室温反应1?2小时。用30kDa的超滤管超滤，除去未反应的1-(3-二甲 氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸，吸取超滤管内剩余液体，加入10mM的硼酸缓冲液恢复为 体积至lmL。
[0033] ③将抗A族链球菌抗体加入lOOkDa的超滤管中，用10mM硼酸缓冲液调整抗体含 量为4mg/mL的。
[0034] ④按200 μ g/lmL的量，将步骤②制备的抗体加入到步骤①量子点溶液中，室温反 应1?2小时。
[0035] ⑤按10 μ L/lmL的量，向步骤③中加入10mg/mL的甘氨酸，封闭未偶联抗体的活化 羧基位点，反应30?60min。
[0036] ⑥将偶联抗体的量子点溶液加入到30kDa的超滤管中，加入pH9.0浓度0.05M Tris-HCl溶液置换溶液缓冲体系。重复3?5次，吸取超滤管中的液体，加Tris-HCl至终 体积为100 μ L。
[0037] ⑦将步骤⑥中的溶在液4°C 1800g离心，取上清液。
[0038] ⑧在步骤⑦所得的上清液中加入100 μ L抗体保存液，所述的体保存液为含1% BSA，20%蔗糖，10%海藻糖，0. 1%吐温-20和0. 1%聚乙烯吡咯烷酮的0. 05Μ Tris-HCl缓 冲液。
[0039] ⑧将上述所得的溶液用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为1?5 μ L/cm (优 选2 μ L/cm)，放入37°C烘箱，干燥2?5小时。
[0040] 3)包被膜的制备方法是：
[0041] ①将羊抗兔抗体用0. 02M磷酸盐缓冲液稀释至lmg/mL，加入3%的甲醇，即为质控 区工作液。
[0042] ②将抗A族链球菌抗体用0. 02M磷酸盐缓冲液稀释至1. 2mg/mL，加入3%的甲醇， 即为检测区工作液。
[0043] ③将①、②所得的溶液，用喷金划膜仪以1 μ L/cm包被到硝酸纤维膜上。检测区与 质控区间距为0. 4?0. 7cm (优选0. 5cm)，位于硝酸纤维素膜中间位置。
[0044] ④将步骤③硝酸纤维膜放入37 °C烘箱中，干燥过夜。
[0045] 4)组装：
[0046] ①硝酸纤维素膜的粘贴：轻轻揭开PVC板上NC膜粘贴处的保护膜，将NC膜从左向 右均匀推进，使其牢固的粘贴在PVC板上。
[0047] ②吸水垫的粘贴：将PVC板平铺于工作台面上；轻轻揭开PVC板上吸收垫粘贴处 的保护膜，将吸收垫粘附于其上，均匀、轻微滚动式推进，以加强粘合力，并防止产生气泡， 吸收垫覆盖在NC膜上1mm。
[0048] ③量子点标记垫的粘贴：将量子点标记垫裁为5mmX 300mm。轻轻揭开NC膜上缘 量子点标记垫粘贴处的保护膜，将胶体金量子点标记垫粘附于其上，方法同吸收垫。胶体金 量子点标记垫覆盖在NC膜上1mm。
[0049] ④样品垫的粘贴：将干燥后的样品垫裁为18mmX 300mm后，轻轻揭开薄板最上端 的保护膜，将样品垫粘附于胶体金量子点标记垫上部，方法同吸收垫。样品垫覆盖在胶体金 量子点标记垫上2mm。
[0050] ⑤量子点标记垫的加固：将衔接胶带裁为12mmX 300mm，粘贴到样品垫处，顶端距 试纸条样品垫端15mm。
[0051] ⑥切条与装卡：将粘贴好的PVC板切成3. 0mm(2. 5?4. 5mm)宽的试纸条。将每一 试纸条装入塑料卡内，将每一试剂卡置于铝膜袋中，并加入lg干燥剂1包，热合封口。
[0052] 该A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的具体使用方法：
[0053] 取样后，在抽提管中加入裂解液A(1M亚硝酸钠）和裂解液B(2M乙酸）各3?4 滴，放入棉拭子后挤压几次，静置3?5min。
[0054] 检测时，参阅图5和图6,将样本裂解液滴入本检测试剂的加样孔中3?4滴，由于 毛细管作用检测样品将沿着检测试纸向吸水板端移动，样品中的A族链球菌经过裂解液裂 解后，可与抗A族链球菌多克隆抗体荧光标记探针发生特异结合，然后继续移动与包被在 硝酸纤维素膜上的抗体结合，从而被抗A族链球菌的多克隆抗体识别，即发生双抗体夹心 的特异结合，用手持式紫外线灯照射观察窗口，检测区出现量子点荧光条带，从而通过检测 样本中的A族链球菌进行呼吸道感染病源的鉴定。检测过程中，当上行液面即滞留于检测 区的荧光探针将显示相应的荧光。即设定A族链球菌界限值为10 3CFU/mL，当质控区和检测 区都有荧光出现时，说明样品中A族链球菌的含量超过103CFU/mL，为阳性；当只有质控区 有荧光而检测区无荧光出现时，说明样品中不含A族链球菌或者含量低于10 3CFU/mL，为阴 性。
[0055] 当移动至羊抗兔多克隆抗体质控区时，无论样品中有无 A族链球菌，荧光探针都 会与硝酸纤维素膜上包被的羊抗兔IgG结合滞留，使质控区显示荧光。因此质控区无荧光 产生则代表操作有误或检测结果无效，需重复试验。
[0056] 为了更好的说明本实用新型的有益效果，下面给出采用本实用新型提供的检测试 剂卡与传统的细菌培养检测法，临床经验甄别发的结果对比实验。
[0057] 检测例1
[0058]
【权利要求】
1. 一种A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，包括带盒盖的盒体￠)，盒体￠)内设 有检测试纸，其特征在于，所述的盒体￠)的盒盖￠1)上设有加样孔（71)和结果观察窗口 (72);所述的检测试纸包括底板（1)，底板（1)上依次衔接有样品垫（2)、抗A族链球菌抗体 量子点标记垫（3)、包被膜（4)和吸水垫（5)，所述的包被膜（4)上设有一条A族链球菌抗 体检测区T线和一条羊抗兔多克隆抗体质控区C线，两条线平行排列。
2. 根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的 包被膜（4)两端分别与吸水垫（5)和抗A族链球菌抗体量子点标记垫（3)相互交叠连接， 在抗A族链球菌抗体量子点标记垫（3)上压贴有样品垫（2)。
3. 根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的 样品垫（2)为玻璃纤维样品垫。
4. 根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的 包被膜（4)为硝酸纤维素膜。
5. 根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的 抗A族链球菌抗体量子点标记垫为包被量子点标记A族链球菌抗体聚酯纤维素膜。
6. 根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，样品 垫（2)压在抗A族链球菌抗体量子点标记垫（3)的1/3?1/4处，抗A族链球菌抗体量子 点标记垫（3)压在包被膜（4)的1mm处，吸水垫（5)压在包被膜（4) 1?2. 5mm处，A族链 球菌抗体检测区T线距离包被膜（4)左端10mm，羊抗兔多克隆抗体质控区C线距离包被膜 (4)右端10mm，C、T线间距4?7mm。
【文档编号】G01N33/531GK203870107SQ201420217173
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】汤永平, 张晓丽, 潘秀华 申请人:广州市微米生物科技有限公司