一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0002] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测海豚链球菌的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003] 鱼类链球菌病是一种由链球菌感染引起的疾病，病原菌归属3个属和7个种。 链球菌属的病原菌有海豚链球菌（Streptococcusiniae)、无乳链球菌（Streptococcus agalactme)、副乳房炎链球菌（Streptococcusparauberis)及停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae);乳球菌属的有格氏乳球菌（Lactococcusgarvieae)和鱼乳球菌 (Lactococcuspiscium);漫游菌属的有鲑鱼漫游菌（Vagococcussalmoninarum)。其中， 海豚链球菌、无乳链球菌、副乳房炎链球菌、停乳链球菌及格氏乳球菌为暖水鱼类链球菌病 的病原菌，而鱼乳球菌和鲑鱼漫游菌属于冷水性鱼类链球菌病的病原菌。
[0004]目前发现海豚链球菌和无乳链球菌是引起多种野生鱼类和经济养殖鱼类链球菌 病的最主要两种病原。其中，由海豚链球菌引起的链球菌病在全世界范围内可引发多种淡 水和海水鱼类大面积感染，具有很高感染率和致死率。该菌可感染包括虹鳟鱼、海鲤、罗非 鱼、黄狮鱼、鲶鱼、白花鱼、鲱鱼、鲻鱼等在内的17种鱼类。
[0005] 链球菌病呈全球流行，每年给世界罗非鱼产业造成巨额经济损失。在中国，2001~ 2006年罗非鱼养殖陆续出现链球菌病，并在个别养殖场造成5~15%的累计死亡率。 2009~2012连续4年，该病在中国罗非鱼主要养殖区大面积暴发流行，累计死亡率在15~ 95%之间，给我国罗非鱼养殖业造成的经济损失累计高达16亿美元。如何快捷、高效、准确 地诊断海豚链球菌病就显得格外重要。
[0006]目前，鱼类海豚链球菌的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法 是通过对细菌的表型特征和生化指标进行鉴定。鉴定海豚链球菌的生化指标主要包括：革 兰氏染色、氧化酶实验、过氧化氧酶实验、CAMP实验、V-P反应（福格斯-普利斯考尔）产物 实验、凝集实验、ELISA实验；Lancefield氏群特异性抗原群鉴定等。但常规鉴定方法存在 操作复杂，所需时间长以及特异性不强的缺点。目前有一些自动快速细菌鉴定系统用于链 球菌鉴定，如RAPIDStrepstrip、APIrapidstrep32、API20EVitek系统、ATB快速检 测系统等，但细菌自动鉴定仪器检测海豚链球菌的结果不稳定，且由于细菌自动化鉴定的 数据库中模式菌株数量有限，链球菌的关键数据尚在研究中，因此该方法的应用也受到限 制。
[0007] 利用基因组16SrRNA基因开发的特异性聚合酶链式反应（PCR)方法常用于鉴定链 球菌。此外，还有利用16S-23SrDNA序列、乳酸氧化酶（lctO)和CAMP因子等对链球菌进 行快速PCR鉴定。另外，也建立了海豚链球菌的双重PCR方法和巢式PCR方法用于检测海 豚链球菌。虽然PCR方法较常规方法快速准确，但需要复杂的仪器设备，成本较高，不适合 基层和现场检测。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测鱼类海豚链球菌的方法， 公开一种快速、可视化并可实时定量的检测海豚链球菌的环介导等温扩增试剂盒。为实现 本发明目的所提供的技术方案为：一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括 LAMP引物、2X反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和海豚链球菌DNA 模板，所述的LAMP引物包括外引物F3(SEQIDN0:1)与B3(SEQIDN0:2)和内引物FIP (SEQIDNO:3)与BIP(SEQIDNO:4); 其中引物的序列分别为： F3AAGCAGATTTGGAACAAGC B3TTTAAGAGCAGGTTTTTCTTCT FIPTCTGCCAATTGTTTTTGAAGTTCAGTGCACGAGAATTAGATACGC BIPAACACAGAATTAACAGCAACTGTTGGCTTCTTTCTTAGCCGCT； 所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0009] 所述的海豚链球菌DNA模板提取自海豚链球菌培养物，使用细菌基因组DNA提取 试剂盒提取。
[0010] 所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0011]所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL30-60mM、KCL25-40mM、MgS04 15-25mM、 (NH4)2S04 2 5-30mM、Tween20 0.3-0.7%、Betaine1.5-3.5M和dNTPs3-5mM，其配制方法 在pH为8. 8条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0012] 一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测疑似海豚链球菌，具体 检测步骤包括： (1) LAMP引物的设计与合成 (2) 海豚链球菌DNA模板的提取 (3) LAMP反应体系建立 (4) LAMP检测方法。
[0013] 所述LAMP反应体系建立以25iiL计， 2X反应缓冲液 12. 5yL BstDNA聚合酶 1iiL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 海豚链球菌DNA 2uL 超纯水 补足25iiL。
[0014] 所述的LAMP检测方法检测样品溶液为提取的海豚链球菌、对照细菌以及临床分 离菌的基因组DNA。
[0015] 所述的LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应 温度为63°C、反应在20-30分钟间出现扩增。
[0016] 本发明的实质性特点和显著进步是： 1)特异性强 本发明的环介导等温扩增试剂盒特异性检测出海豚链球菌，所检测的阴性对照病毒、 阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。
[0017] 2)灵敏度高 普通的PCR检测方法的灵敏度为1. 7X1(T6ng/yL，而使用本发明检测方法，检测限约 为1.7父10_81^/111，比普通？0?的灵敏度提高了将近100倍。
[0018] 3)迅速得出结果 普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在 反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从细菌DNA提取到获取 试验结果，需要5-6小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在20-30分钟间出现扩 增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过 肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明 显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫 外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像 或者开盖加入荧光染料进行来判读结果，从细菌DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内 完成。
[0019] 4)不造成污染 目前虽然已经建立有LAMP显色法用于检测海豚链球菌，但显色法只能是反应结束后 开盖加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，开盖容易造成实验室 污染。而本发明的LAMP荧光目视检测方法，荧光染料是在反应前加入，避免开盖造成污染， 此外，本发明的LAMP检测方法在结果判定上，可以直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来 判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖， 能有效避免污染。
[0020] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320池度仪来实时分析LAMP反应的结果，不 同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求 出各时间的海豚链球菌拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0021] 图1是本方明LAMP方法特异性检测结果；其中1、海豚链球菌；2、大肠杆菌；3、嗜 水气单胞菌；4、维氏气单胞菌；5、鮰爱德华氏单胞菌；6、哈氏孤菌；7、创伤孤菌；8、无乳链 球菌；9、阴沟肠杆菌；10、水对照。结果显示1株鱼海豚链球菌反应管出现浊度的上升曲线， 8株阴性对照菌反应管和水对照反应均无扩增。
[0022] 图2和图3是本发明LAMP检测方法及传统PCR方法的敏感性检测结果；其 中A: 1. 7X102ng/iiL;B: :1. 7X101ng/iiL;C: 1. 7X10。ng/iiL;D: 1. 7X1CT1ng/iiL; E: 1. 7X1(T2ng/iiL;F:1. 7Xl(T3ng/iiL;G: 1. 7X1(T4ng/iiL;H: 1. 7X1(T5ng/iiL; 1:1. 7X1CT6ng/iiL;J: 1. 7X1CT7ng/iiL;K: 1. 7X1CT8ng/iiL;L:water。重组质粒pMD18-T-&i的起始浓度为1. 7X10 2ng/iiL，经10倍倍比稀释后进行LAMP和PCR扩增，结 果显示LAMP法检测限约为1. 7X10_8ng/iiL，而PCR法检测限为1. 7X10_6ng/iiL。
[0023] 图4是加入荧光染料检测结果：右管为以海豚链球菌基因组DNA为模板的反应情 况，为阳性结果，左管为阴性对照的反应情况，为阴性对照结果。
[0024] 图5是本发明定量检测海豚链球菌LAMP方法的标准曲线；利用不同的标准样品的 浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的海豚