基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米MIR604检测方法与流程

本发明涉及分子生物学及生物检测技术领域，具体地说，涉及基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米MIR604检测方法与检测试剂盒。

背景技术：

转基因玉米品系MIR604由瑞士先正达公司2005年研发，具有抗虫特性，采用根瘤农杆菌介导转化方法，转入Cry3A基因，可表达mCry3A抗虫毒蛋白。2007年起，美国、菲律宾、墨西哥、俄罗斯、韩国、日本、加拿大和欧盟相继批准转基因玉米品系MIR604可进口作为食品和饲料的加工原料，美国2012年更是批准其在境内28个州实验种植登记。我国于2008年批准转基因玉米品系MIR604进口作为食品和饲料的加工原料。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是Notomi等于2000年发明的一种新型的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下(60-65℃)反应，在1h内即可完成核酸扩增反应，目的片段可以扩增10⁹倍。该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、省时、操作简单等优点，在核酸检测方面具有明显优势。目前环介导等温检测技术的产物检测方法主要有浊度法、染料法、电泳法以及核酸试纸条，但是这些方法都容易引起交叉污染。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明建立了一种针对于转基因玉米MIR604的检测方法，本发明的一个目的是提供了一套环介导等温扩增技术快速检测用引物；本发明的第二个目的是建立了环介导等温扩增检测方法；根据检测方法实现了本发明的第三个目的，提供了使用上述检测用引物的试剂盒；本发明的试剂盒和检测方法具有简便、灵敏、快速、特异性好等特点，提供了一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米MIR604的检测方法。

本发明的第一个目的提供一种环介导等温扩增消光技术检测转基因玉米MIR604方法的4条检测引物，序列分别为：

上游外引物，MIR604-F3：

CTGGGAGGGAGGGAGGGAAGCCCCACCTGTTCGA(SEQ ID NO.1)，

下游外引物，MIR604-B3：

CTGGGAGGGAGGGAGGGGGCTCGCTGCTCTTGTTG(SEQ ID NO.2)；

上游内引物，MIR604-FIP：

AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGCTGGGAGGGAGGGAGGGACCTCACCGCATCCAGTTC(SEQ ID NO.3)

下游内引物，MIR604-BIP：

GGAGCGGCAACTACGTGAGCTGGGAGGGAGGGAGGGAGAAGGGGCTGGTGATGA(SEQ ID NO.4)

核酶是一种具有类过氧化物酶活性、富含鸟嘌呤的单链DNA分子，在特定的条件下能够折叠成G4重结构，在H₂O₂存在下能够催化无色底物2,2′-连氮基-双-(3-乙基并二氢噻唑啉-6-磺酸)二价阴离子(ABTS^2-)氧化成蓝绿色物质ABTS^-·自由基。当存在单链DNA分子的互补链时，这种类过氧化物酶的活性降低甚至消失。将折中显色/消光技术结合到环介导等温扩增技术上，利用引物显色，产物消光的手段，来验证目的片段的存在。

本发明通过巧妙地设计引物，使引物既可高效扩增转基因玉米MIR604的cry3A基因，又可作为具有类过氧化物酶活性单链DNA分子，实现上述功能。

第二方面，本发明提供了一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米MIR604的方法，即利用环介导等温扩增消光技术用前述引物对样品的DNA进行扩增，通过检测是否有扩增产物来判断是否存在Cry3A基因，从而判断是否存在转基因玉米MIR604。

本发明提供的检测转基因玉米MIR604的方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品基因组模板；

(2)显色反应：将hemin工作液与本发明SEQ ID NO.1-4所述引物混合，添加ABTS显色液和H₂O₂后得到显色反应混合液，立刻记录颜色或在419nm处测定吸光值；

(3)环介导等温扩增消光反应：向显色反应混合液中添加样品基因组模板，在60～65℃进行环介导等温扩增消光反应40～60min；

(4)产物检测：目视判定反应颜色，或在419nm处测定吸光值，通过与步骤(2)的结果比较，判断是否有扩增产物，当颜色由蓝色变为浅色或无色或者当OD_419nm值变小，说明有目的产物，待测样品为转基因玉米MIR604阳性。

步骤(2)中，将40～60μM的hemin工作液与1.25μM的上游外引物和下游外引物以及10μM的上游内引物和下游内引物混合，在35～45℃条件下孵育20～30min，添加30～40mM的ABTS显色液和50～60mM的H₂O₂后得到显色反应混合液。

其中，步骤(3)是向显色反应混合液中添加1.4～2.0mM dNTP、3～8mM MgSO₄、0.6～0.8M甜菜碱、3.6～10.0U Bst DNA聚合酶大片段、1×Thermopol buffer，2μL样品基因组模板，再进行环介导等温扩增消光反应。

所述hemin工作液由hemin溶于工作液配制，该工作液含有10mM NaH₂PO₄、100mM KCl、2mM MgCl₂以及0.003％Triton X-100。

在该显色体系条件下进行显色反应，能够保证引物最大程度的折叠成G4结构，与hemin充分结合，发挥出类过氧化物酶的最大活性，保证显色程度最佳；在该扩增体系条件下进行扩增，能够保证引物的扩增效率不受影响，在短时间内实现快速扩增，保证尽可能多的核酶引物形成双链产物，从而失去类过氧化物酶活性，使得反应体系消光。

第三方面，本发明提供一种检测转基因玉米MIR604的试剂盒，含有序列如SEQ ID NO.1-4所示的引物。

进一步地，本发明的试剂盒还含有工作液、hemin、ABTS粉剂、DMSO缓冲液、30％H₂O₂，以及1×Thermopol buffer、dNTP、MgSO₄、甜菜碱组成的反应液和Bst DNA聚合酶；所述工作液含有10mM NaH₂PO₄、100mM KCl、2mM MgCl₂以及0.003％TritonX-100。

优选地，反应液是由体积比为5:8:1:10的1×Thermopol buffer、1.4-2.0mM dNTP、3-8mM MgSO₄、0.6-0.8M甜菜碱组成。

在所述试剂盒中，所述引物以引物混合液的形式存在，所述引物混合液中含有1.25μM的上游外引物MIR604-F3和下游外引物MIR604-B3，含有10μM的上游内引物MIR604-FIP和下游内引物MIR604-BIP。

Bst DNA聚合酶冻干在PCR管内底部。其中混合液、工作液、ABTS粉剂、DMSO缓冲液、30％H₂O₂可常温保存，反应液需4℃保存，Bst DNA聚合酶需-20℃保存。

本发明提供了上述试剂盒在检测转基因玉米中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、反应快速，一般情况下在15～30min即可有大量的扩增产物生产，为了保证检测的准确度，本发明选择反应时长为40min，在此时间内即可将模板扩增10⁹倍，该方法操作简便，适于核酸分子的快速检测。

2、特异性好，该技术对靶基因的6个区域设计引物，引物具有更高的特异性。

3、灵敏度高，该技术反应速度快，对于痕量目的基因可以达到很好的检测效果，灵敏度比PCR方法高一到两个数量级，该技术为转基因产品的监督检测提供了技术支持。

4、操作简单，适于基层使用。本发明设计了检测转基因玉米MIR604的试剂盒，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层检测使用。

附图说明

图1为本发明实施例5中环介导等温消光扩增反应电泳结果；其中，泳道1为阴性扩增，泳道2为阳性扩增，M为D2000maker。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1引物的设计与确定

通过日本荣岩株式会社环介导引物在线设计软件LAMP primer designing software primerexplorer V4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)针对转基因玉米MIR604的Cry3A基因序列设计引物，使引物既可扩增转基因玉米MIR604的cry3A基因，又可作为具有类过氧化物酶活性、富含鸟嘌呤的单链DNA分子，使其能够在特定的条件下折叠成G4重结构，在H₂O₂存在下能够催化无色底物2,2′-连氮基-双-(3-乙基并二氢噻唑啉-6-磺酸)二价阴离子(ABTS^2-)氧化成蓝绿色物质ABTS^-·自由基。当存在单链DNA分子的互补链时，类过氧化物酶的活性降低甚至消失。将折中显色/消光技术结合到环介导等温扩增技术上，利用引物显色，产物消光的手段，来验证目的片段的存在。引物由上海英潍捷基有限公司合成，将引物稀释为10μmol/L。

经过反复筛选研究，排除效果较差的引物组合，本发明设计的最佳检测效果的引物为：

上游外引物，MIR604-F3：

CTGGGAGGGAGGGAGGG AAGCCCCACCTGTTCGA(SEQ ID NO.1)，

下游外引物，MIR604-B3：

CTGGGAGGGAGGGAGGG GGCTCGCTGCTCTTGTTG(SEQ ID NO.2)；

上游内引物，MIR604-FIP：

AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGCTGGGAGGGAGGGAGGGACCTCACCGCATCCAGTTC(SEQ ID NO.3)

下游内引物，MIR604-BIP：

GGAGCGGCAACTACGTGAGCTGGGAGGGAGGGAGGGAGAAGGGGCTGGTGATGA(SEQ ID NO.4)

与普通LAMP引物相比，本发明的内侧引物由两条引物以及DNAzyme序列构成，根据引物设计原则，添加DNAzyme序列后F1c与F2之间序列边长，则要求F1c与F2之间原始序列不超过35bp，同理B1与B2c之间原始序列不超过35bp，否则，内侧引物则无法折叠成哑铃状结构。

实施例2转基因玉米MIR604检测方法的建立

(1)称取100mg转基因玉米MIR604粉，用CTAB方法提取基因组；

(2)选用实施例1筛选的最佳引物进行实验，引物由上海英潍捷基有限公司合成，将引物稀释为10μmol/L；

(3)对影响显色反应的因素(hemin、孵育温度、时间、ABTS、H₂O₂)进行了优化，确定最优的显色/消光反应体系：50μM hemin工作液，添加1.25μM外引物MIR604-F3和MIR604-B3，10μM内引物MIR604-FIP和MIR604-BIP，40℃孵育30min，然后添加36mM ABTS显色液，60mM H₂O₂，立即判定颜色，测定OD₄₁₉；

(4)LAMP扩增反应体系：向(3)的反应液中添加1.6mMdNTP、6mM MgSO₄、0.8M甜菜碱，8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol buffer。扩增反应程序：65℃反应40min；

(5)结果分析：扩增后颜色由蓝色变浅或无色，或OD₄₁₉值变小，说明含有目的产物。

实施例3环介导等温扩增消光反应体系及反应条件的优化

为保证显色体系最佳，本发明对下述各反应因素进行优化。

1.显色时间的优化

40μM hemin工作液，添加1.25μM外引物MIR604-F3和MIR604-B3，10μM内引物MIR604-FIP和MIR604-BIP，35℃孵育30min，然后添加30mM ABTS显色液，60mM H₂O₂。利用紫外分光光度计测定所得反应混合液在0s、30s、1min、2min、5min、10min、30min的OD_419nm值。阴性对照不添加引物，用ddH₂O替代。根据表1结果可知，随着时间的延长，阳性和阴性的显色都会显著增加，通过阳性和阴性的比值发现，测量时间越早越好，本发明采用显色后立即测定OD值。

表1不同显色时间下的显色结果

2.孵育温度和时间的优化

阳性反应(+)：40μM hemin工作液，添加1.25μM外引物MIR604-F3和MIR604-B3，10μM内引物MIR604-FIP和MIR604-BIP，35-45℃孵育20-30min，然后添加30mM ABTS显色液，60mM H₂O₂，利用紫外分光光度计立即测定所得反应混合液的OD_419nm值。阴性对照(-)不添加引物，用ddH₂O替代。根据表2结果可知，随着时间的延长，阳性和阴性的显色都会逐渐增加，通过阳性和阴性的比值发现，后期结果差异不大，本发明采用的孵育条件为40℃，30min。

表2不同孵育温度及时间下的显色结果(OD_419nm值)

3.浓度的优化

40-60μM hemin工作液，添加1.25μM外引物MIR604-F3和MIR604-B3，10μM内引物MIR604-FIP和MIR604-BIP，40℃孵育30min，然后添加30-50mM ABTS显色液，60mM H₂O₂，利用紫外分光光度计立即测定所得反应混合液的OD_419nm值。阴性对照不添加引物，用ddH₂O替代。根据表3结果可知，随着hemin浓度的增加，阳性(+)的显色都会逐渐增加，这是由于与核酶结合的量增加了，随着ABTS浓度的增加，阳性的显色逐渐增加，但是阴性(-)的显色也会逐渐增加，这是由于显色底物本身的颜色增加了，背景值的增加造成阳性和阴性的比值下降，本发明采用的最有条件为hemin 50μM,ABTS36mM。

表3不同hemin工作液及ABTS显色液的显色结果(OD_419nm值)

实施例4试剂盒检测样品中转基因玉米MIR604的特异性及灵敏度

(1)样品基因组模板制备：称100mg粉状样品，用CTAB方法提取基因组，样品包含：转基因玉米MIR604，转基因玉米MON810，转基因玉米Bt176，非转基因玉米，转基因大豆GTS-40-3-2，转基因水稻TT51-1和转基因油菜GT73。灵敏度验证时将转基因玉米MIR604基因组的浓度调整为10⁵pg/μL，然后将此浓度的基因组10倍倍比稀释为10⁴，10³，10²，10，1pg/μL，制备成系列剃度浓度的标准DNA模板。

(2)显色反应：配制50μM hemin工作液、36mM ABTS显色液以及60mM H₂O₂，在含有Bst DNA聚合酶冻干粉的PCR管中配制反应体系，添加引物混合物9μL，hemin反应液90μL，40℃孵育30min，添加ABTS显色液29μL以及1μL H₂O₂，立即判定颜色，测定OD₄₁₉。

(3)环介导等温扩增消光反应：上述混合液中，添加反应液12μL，DNA模板2μL，65℃水浴锅中反应40min，判定颜色，测定OD₄₁₉。

(4)结果分析：反应前后的OD₄₁₉值见下表，规定反应前OD₄₁₉为A，反应后OD₄₁₉为B。显色反应液最初呈蓝色，扩增后，含有样品基因组的反应液接近无色，OD₄₁₉降低，阴性对照为不添加基因组模板反应液仍然呈蓝色，OD₄₁₉维持不变，由此判定含有转基因玉米MIR604成分。

表4试剂盒检测样品中转基因玉米MIR604的特异性及灵敏度

由表4可知，只有转基因玉米MIR604发生了消光反应，其余对照的OD₄₁₉基本保持一致，证明该检测方法具有较好的特异性。灵敏度试验中，阳性OD_419nm值随着基因组浓度的增加而降低，阴性对照OD_419nm值与原OD值基本一致，由此判定本方法的最低检测限为10pg。

实施例5含有本发明引物的试剂盒检测样品中转基因玉米MIR604成分

(1)基因组模板的提取：称100mg待测样品，用CTAB方法提取基因组。

(2)显色反应：配制50μM hemin工作液、36mM ABTS显色液以及60mM H₂O₂，在含有Bst DNA聚合酶冻干粉的PCR管中配制反应体系，添加引物混合物9μL，hemin反应液90μL，40℃孵育30min，添加ABTS显色液29μL以及1μL H₂O₂，立即判定颜色，测定OD₄₁₉。

(3)环介导等温扩增消光反应：上述混合液中，添加反应液12μL，DNA模板2μL，65℃水浴锅中反应40min，判定颜色，测定OD₄₁₉。

(4)结果分析：步骤(2)中显色反应液呈蓝色，OD₄₁₉为0.71564，扩增后反应液接近无色，OD₄₁₉为0.06258，阴性对照反应液呈蓝色，OD₄₁₉为0.70024，扩增后反应液维持蓝色，OD₄₁₉为0.69431，差异不大。经过上述环介导等温消光扩增，得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，表现出典型的LAMP阶梯状产物条带。该结果表明本发明试剂盒可直接用于转基因玉米MIR604的检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米MIR604检测方法

<130> KHP161116349.3

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgggaggga gggagggaag ccccacctgt tcga 34

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgggaggga gggagggggc tcgctgctct tgttg 35

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agttgaagct gtcgttgccg ctgggaggga gggagggacc tgcaccgcat ccagttc 57

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagcggcaa ctacgtgagc tgggagggag ggagggagaa ggggctggtg atga 54