本发明涉及淡水养殖动物病原检测技术，具体是涉及一种气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
气单胞菌是条件致病菌，广泛分布在淡水水产养殖环境中。迄今已被报道过的淡水养殖动物病原气单胞菌有很多种。其中，嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、温和气单胞菌(A.sobria)、维氏气单胞菌(A.veronii)、等多种气单胞菌被认为是淡水水产动物的重要致病菌,可以引起如甲壳类(Sung等,2001；Soto-Rodrigu等,2010；Alagappan等,2010；Phumkhachom和Rattanachaikunsopon,2010；Ji等,2011；Raissy等,2011),双壳类(Tubiase等,1970；Beaz-Hidalgo等,2010)，鱼类(Toranzo等,2005；Wo等,2008；Pal和Das,2010；Frans等,2011)等有重要商业价值的动物疾病；其中嗜水气单胞菌、温和气单胞菌等某些种类也是人类的食源性病原(Tracz等,2007)。这些细菌可以导致水产养殖业巨大的经济损失，引起人体严重的并发症。另外，近几年我国出口的水产品也曾发生过多起因病原性气单胞菌超标引起的退货、销毁、取消注册代号事件，造成了巨大的经济损失。因此致病性气单胞菌菌的快速检测技术，对维持淡水养殖业的健康可持续发展、水产品卫生质量监督和保护公众健康等方面都具有十分重要的意义。但现行的气单胞菌检测方法针对样品单一，而且操作步骤繁琐，不易实现现场批量检测，很难满足淡水养殖动物病害防治的需要。现行检测致病性气单胞菌主要有三种方法：①生理生化鉴定法，该法操作步骤繁琐，费时费力；②酶联免疫吸附试验(ELISA)，该法虽检测快速、灵敏度高、可用于大批量检测等特点，但对新鲜样品进行检测时易出现假阳性问题，在一定程度上限制了在生产实践中的应用；③聚合酶链式反应法(PCR)，该法快速、灵敏，但需要昂贵的核酸扩增仪，同样限制了在生产实践中的应用。
近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP)，是一种新型的恒温核酸扩增方法，可以有选择性地高效扩增靶基因序列，产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现出不同大小区带组成的阶梯式图谱。LAMP与其它致病性气单胞菌检测方法相比优点明显：①虽然反应原理、引物设计比较复杂，但是在恒温条件下扩增，只需要一个恒温装置(如水浴锅、保温杯等)就可以进行；②高效灵敏，模板仅需要10个拷贝或更少；③特异性强，应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增；④检测时间短，扩增可以在60min内完成；⑤产物可以通过直接在反应管中加入荧光染料染色，结果形象直观。通过比对常见气单胞菌16S RNA发现有多处高度保守序列，根据这些高度保守序列设计特异性引物，即可快速检测气单胞菌属细菌的存在。因此将LAMP技术应用于致病性气单胞菌的通用检测可实现现场样本的大批量快速检测。CN 102140512 B公开了致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒，根据靶基因序列设计了致病嗜水气单胞菌检测用引物组，能特异性识别靶序列上的八个独立区域，增强了致病嗜水气单胞菌检测的特异性，所以该发明仅能针对嗜水气单胞菌这一单个气单胞菌来进行特异性检测。
在水产养殖的病害检测、食品安全检验等实践中，第一时间确定是否有气单胞菌感染比知道具体由哪种气单胞菌感染的意义更大。而现有技术中由于对不同气单胞菌(如嗜水气单孢菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌等)要进行逐一特异性检测，费时费力，不能使用一次检测确定是否有气单胞菌感染。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，针对以上现有技术的缺点，提供一种气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒及其检测方法，能够一次检测确定是否有气单胞菌。
本发明的技术方案是：一种气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒，它包括：
1)研磨液管：内装研磨液，
2)核酸提取液A管：内装乙酸钠溶液；
3)核酸提取液B管：内装无水乙醇；
4)核酸提取液C管：内装质量浓度70％的乙醇溶液；
5)TE缓冲液管：内装TE缓冲液；
6)UNG酶管：内装尿嘧啶DNA糖基化酶；
7)LAMP反应液管：内装LAMP反应液；
8)Bst DNA聚合酶管：内装Bst DNA聚合酶；
9)显色剂管：内装核酸染料SYBR Green I；
10)阳性对照核酸管：内装气单胞菌阳性DNA；
11)阴性对照管：内装灭菌的双蒸水。
优选地，所述研磨液由以下体积百分数的组分组成：三羟甲基氨基甲烷5～10％、乙二胺四乙酸二钠0.5～2.0％、十二烷基磺酸钠5～10％、巯基乙醇0.01～1.0％、8-羟基喹啉0.01～0.02％、平衡酚5～10％、氯仿5～10％，余量为双蒸水；所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为1～2M；所述乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.25～1.0M；所述十二烷基磺酸钠的质量分数为5～10％。
优选地，所述LAMP反应液由以下浓度的组分组成：LAMP引物Aeromonas-FIP和Aeromonas-BIP各1～4μM，LAMP引物Aeromonas-F3和Aeromonas-B3各0.1～0.5μM，dATP、dGTP和dCTP各0.5～2mM，dTTP、dUTP各0.25～1mM，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，(NH4)2SO4 5～15mM，MgSO4 1～4mM，Triton X-100 0.05％～1.0％，Betaine 0.8～1.2M，溶剂为双蒸水。
进一步优选地，LAMP引物的核酸序列如下：
Aeromonas-FIP[SEQ ID NO.1]：
GCAATATTCCCCACTGCTGCCTAGGATCAGCCACACTGGAACTG；
Aeromonas-BIP[SEQ ID NO.2]：
CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGTTTGCTACCAACCTTTCCTCCTC；
Aeromonas-F3[SEQ ID NO.3]：
CCCTAGCTGGTCTGAGAGG；
Aeromonas-B3[SEQ ID NO.4]：
TCTTCTGCGAGTAACGTCAC。
优选地，气单胞菌阳性DNA的制备方法如下：用位于LAMP目标片段上下游的PCR引物(Aeromonas-Pf[SEQ ID NO.5]:5'-GAGGAAAGGTTGGTAGCGAA；Aeromonas-Pr[SEQ ID NO.6]:5'-ACCCCCCTCTACAAGACTC)，对嗜水气单孢菌基因组DNA进行扩增，扩增条件为：92～96℃预变性5～10min，92～96℃变性20～40s，56～60℃退火20～40s，70～74℃延伸50～70s完成一个扩增循环，重复循环35～35轮，最后70～75℃延伸8～12min，2～6℃保存，得到474bp的条带，得到阳性DNA片段(所述阳性DNA片段的序列为SEQ ID NO.7)；回收阳性DNA片段，将其连接到载体pMD-18T-Vector，并转化大肠杆菌感受态细胞JM109，经PCR验证后，提取质粒，得到气单胞菌阳性DNA，稀释后作为气单胞菌阳性对照。该嗜水气单胞菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种，菌种编号：1.1027。所述阳性DNA片段的序列为：GAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGCTGTGTCCTTGAGACGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCTGGAATCCCTAAGAGATTGGGGAGTGCCTTCGGGAATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCAAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGT。在此试剂盒中，此段序列被连接到JM109质粒上，一同作为气单胞菌阳性DNA。
在本发明的试剂盒中，原料以市购的方式获得，其中乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸钠、乙酸钠、氯仿、平衡酚、巯基乙醇、8-羟基喹啉、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、dATP(三磷酸脱氧腺苷)、dGTP(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)、dCTP(三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)、dTTP(三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸)购自上海生物工程有限责任公司，dUTP购自上海闪晶分子生物科技有限公司，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)、Bst DNA聚合晦等购自美国NEB公司，核酸染料SYBR Green I购自北京鼎国生物科技有限公司，Betaine、Triton X-100购自Sigma公司。
LAMP引物Aeromonas-FIP、Aeromonas-BIP、Aeromonas-F3和Aeromonas-B3以及PCR引物Aeromonas-Pf、Aeromonas-Pr是根据本发明的设计，委托上生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明的引物可以检测常见的致病性气单胞菌，只要检出气单胞菌则说明动物或养殖环境中有气单胞菌的存在，即可采取相应的措施。因为气单胞菌病的治疗机预防手段是相似的，生产上并不需要第一时间知道具体的气单胞菌的种类。
一种利用权利要求1～3中任意一种气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒的致病性气单胞菌的检测方法，包括下列步骤：
1)取待测样品组织于离心管I中，加入研磨液，用研磨棒充分磨碎至浆状，
2)将上述研磨所得的浆状样品煮沸后以8000～12000r/min离心5～10min，取上清液置于离心管II中；
3)向装有上清液的离心管II内加入核酸提取液A管内的乙酸钠溶液混匀，再加入-20℃预冷的核酸提取液B管内的无水乙醇混合，静置5～20min，以10000～14000r/min离心5～10min，弃上清液，保留沉淀物；乙酸钠溶液与上清液的体积比为1:12～1:8；无水乙醇与沉淀物的体积比为4:1～4:3；
4)用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤3)所得的沉淀物，然后10000～14000r/min离心5～10min，弃上清液，保留沉淀物；
5)用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤4)所得的沉淀物，然后10000～14000r/min离心5～10min，弃上清液，保留沉淀物；
6)将上述步骤5)所得的沉淀物于室温晾干，加入TE缓冲液溶解沉淀物，得到样品核酸；
7)分别将上述样品核酸、阴性对照管内的双蒸水、阳性对照核酸管内的阳性对照核酸，加至LAMP反应液中，再加入UNG酶，分别得检测管、阴性对照管和阳性对照管；对上述检测管、阴性对照管和阳性对照管均于36～38℃保温5～20min进行酶解；
8)将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管酶解后的反应体系先于90～100℃保温5～10min，然后再迅速置于碎冰块中；
9)向步骤8)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管的反应体系中再分别加入Bst DNA聚合酶；
10)将上述步骤9)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管分别进行如下操作：先于63～65℃保温40～50min，然后于85～95℃保温2～5min完成LAMP反应；
11)LAMP反应结束后，加入核酸染料SYBR Green I，观察检测管内LAMP反应产物的颜色。如果检测管内LAMP反应产物的颜色与阴性对照管反应产物的颜色均呈橙色，则待测品致病性气单胞菌检测结果为阴性；如果检测管内LAMP反应产物的颜色同阳性对照管反应产物的颜色均呈绿色，则待测品致病性气单胞菌检测结果为阳性。
本发明具有以下有益的技术效果：
1)在试剂盒中汇集了气单胞菌检测所需的研磨液、核酸提取液等十种试剂和三种器材，使得气单胞菌检测能有序地进行，实现了检测过程现场化、程序化和标准化，使得操作规范、不易出错，能够有效检测多种常见的气单胞菌属细菌，即一次检测确定是否有气单胞菌；
2)用专门设计的研磨液进行样品的处理，使得样品的处理过程极其简单；
3)UNG酶能消除多次检测过程中的核酸污染，采用尿嘧啶DNA糖基化酶消除LAMP扩增产物的污染，避免了因LAMP产物扩增量大造成的假阳性结果,解决了限制LAMP技术广泛应用的易被污染干扰的问题；
4)实现了可不开盖检测，从源头上避免了污染的产生，进一步避免了假阳性结果的出现；
5)检测方法根据气单胞菌属保守的16s RNA基因区，优选了目的基因区段来设计LAMP特异性引物，使得该引物能有效检测常见的气单胞菌属细菌，并且气单胞菌检测完全具有了LAMP技术灵敏、快速、简便、准确的特点，检测特异性好，检测结果非常容易判别；
6)优化了整个操作过程的技术参数，并将其标准化、配套化，形成检测试剂盒，便于现场大批量应用；
7)使用本发明的试剂盒及检测方法在2小时内就可完成致病性气单胞菌的检测，检测过程无需昂贵的仪器设备如PCR仪和凝胶成像系统，仅需有水浴锅或金属浴和普通离心机即可；
8)与气单胞菌属细菌已有的检测技术相比，本发明的试剂盒及相应检测方法不仅实现了气单胞菌的通用检测，而且成本低、灵敏度高、操作简单，可实现现场快速检测；
9)具有比以往检测方法更高的灵敏度和便捷性，可以替代致病性气单胞菌之前的相关检测方法如生理生化法、PCR法、酶联免疫吸附法等。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例，对本发明做进一步描述。
以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明要求的保护范围之内。
实施例一
一种气单胞菌核酸等温扩增检测试剂盒(5样份，即可用于5样次的检测)，由以下内容物组成：
1)研磨液管，1管，3ml；研磨液配制：1M的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl，pH8.0)10份，0.25M的乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTANa2)2份，质量分数为5％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)10份，巯基乙醇0.5份，8-羟基喹啉0.01份，平衡酚7份，氯仿8份，用双蒸水定容到100份而成。以上份数均为体积份数；
2)核酸提取液A管，1管，内装400μl 3M乙酸钠溶液(pH5.2)；
3)核酸提取液B管，l管，内装10ml无水乙醇；
4)核酸提取液C管，1管，内装10ml质量浓度70％的乙醇溶液；
5)TE缓冲液管，1管，内装400μl TE缓冲液(含10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0，其余为双蒸水)；
6)UNG酶管，1管，内装6U尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)；
7)LAMP反应液管，1管，内装150μl LAMP反应液，
LAMP反应液的组成成分如下：LAMP引物Aeromonas-FIP和Aeromonas-BIP各2μM，LAMP引物Aeromonas-F3和Aeromonas-B3各0.3μM，dATP、dGTP和dCTP各1mM,dTTP、dUTP各0.5mM,Tris-HCl 20mM,KCl 15mM,(NH4)2SO4 10mM,MgSO4 2mM,Triton X-100 0.5％,Betaine 1M；溶剂为双蒸水；
上述LAMP引物根据气单胞菌属保守的16s RNA基因序列设计的，LAMP引物设计的首选软件是PrimerExplore 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，也可以使用常用的引物设计软件(如Primer Primier 5.0或Omiga 2.0)按照LAMP引物的设计要求进行设计。本发明中利用软件PrimerExplore 4.0在线设计的—套LAMP引物的DNA序列如下：
Aeromonas-FIP[SEQ ID NO.1]：
GCAATATTCCCCACTGCTGCCTAGGATCAGCCACACTGGAACTG；
Aeromonas-BIP[SEQ ID NO.2]：
CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGTTTGCTACCAACCTTTCCTCCTC；
Aeromonas-F3[SEQ ID NO.3]：
CCCTAGCTGGTCTGAGAGG；
Aeromonas-B3[SEQ ID NO.4]：
TCTTCTGCGAGTAACGTCAC。
8)Bst DNA聚合酶管，1管，内装5μl Bst DNA聚合酶；
9)显色剂管，1管，内装5μl的液体染料，该液体染料由核酸染料SYBR Green I和双蒸水按照1:100的体积比混合而得；
10)阳性对照核酸管，1管，内装10μl气单胞菌阳性DNA。气单胞菌阳性DNA制备方法如下：提取嗜水气单孢菌基因组DNA，用位于LAMP目标片段上下游的PCR引物(Aeromonas-Pf[SEQ ID NO.5]:5'-GAGGAAAGGTTGGTAGCGAA；Aeromonas-Pr[SEQ ID NO.6]:5'-ACCCCCCTCTACAAGACTC)，对嗜水气单孢菌基因组DNA进行扩增。反应体系为：25μl体系包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液、1.0μl dNTPs(10mM)、1.0μl Aeromonas-Pf和Aeromonas-Pr(20μM)、0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μl，北京鼎国生物科技有限公司)，其余为双蒸水。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s完成一个扩增循环，重复循环30轮，最后72℃10min，4℃保存，得到474bp的条带，回收该片段后，按T载体说明书要求连接到T载体(pMD-18T-Vector，购自大连宝生物公司)上，并按感受态细胞操作要求将重组质粒转化至感受态细胞JM109(购自大连宝生物公司)内，用蓝白斑方法筛选阳性菌，并用引物VIBRIO-Pf和VIBRIO-Pr进行PCR验证(程序同上)。最后用碱法提取阳性菌的质粒，得到气单胞菌阳性DNA，稀释至100拷贝/μl后作为气单胞菌阳性对照。上述嗜水气单胞菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种，菌种编号：1.1027；
11)阴性对照管，1管，内装10μl灭菌双蒸水；
12)研磨棒，5支；
13)包装盒(78×78×50mm)；
14)一块泡沫板，泡沫板高22mm，有三列，共11个孔，第一列四个孔，孔径5.5mm，第二列三个孔，孔径10mm，第三列三个孔，孔径15.5mm。上述1～11的各小管放置于这些小孔中，该泡沫板与上述包装盒的底面大小相同，装于包装盒内；
15)试剂盒使用说明书—份。
实施例二
一种气单胞菌核酸等温扩增检测试剂盒(5样份)，仅以下内容不同于实施例一，其余均同实施例一。
研磨液配制：2M的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl，pH8.0)5份，0.5M的乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTANa2)1份，质量分数7％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)7份，巯基乙醇0.01份，8-羟基喹啉0.02份，平衡酚5份，氯仿10份，以双蒸水定容到100份而成。以上份数均为体积份数。
LAMP反应液的组成成分如下：LAMP引物Aeromonas-FIP和Aeromonas-BIP各4μM，LAMP引物Aeromonas-F3和Aeromonas-B3各0.5μM，dATP、dGTP和dCTP各2mM,dTTP和dUTP各1.0mM,Tris-HCl 40mM,KCl 20mM,(NH4)2SO4 15mM,MgSO44mM,Triton X-100 1.0％,Betaine 0.8M；溶剂为双蒸水。
气单胞菌阳性DNA制备方法如下：用位于LAMP目标片段上下游的PCR引物(Aeromonas-Pf[SEQ ID NO.5]:5'-GAGGAAAGGTTGGTAGCGAA；Aeromonas-Pr[SEQ ID NO.6]:5'-ACCCCCCTCTACAAGACTC)，对嗜水气单孢菌基因组DNA进行扩增，扩增条件为：92℃预变性10min，92℃变性40s，56℃退火40s，70℃延伸70s完成一个扩增循环，重复循环25轮，最后70℃延伸8min，2℃保存，得到474bp的条带，回收该片段后，将其连接到载体pMD-18T-Vector，并转化大肠杆菌感受态细胞JM109，经PCR验证后，提取质粒，得到气单胞菌阳性DNA，稀释至100拷贝/μl后作为气单胞菌阳性对照。
实施例三
一种气单胞菌核酸等温扩增检测试剂盒(5样份)，仅以下内容不同于实施例一，其余均同实施例一。
研磨液配制：1.5M的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl，pH8.0)7份，1.0M的乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTANa2)0.5份，质量分数10％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)5份，巯基乙醇0.01份，8-羟基喹啉0.015份，平衡酚10份，氯仿10份，以双蒸水定容到100份而成。以上份数均为体积份。
LAMP反应液的组成成分如下：LAMP引物Aeromonas-FIP和Aeromonas-BIP各1μM，LAMP引物Aeromonas-F3和Aeromonas-B3各0.25μM，dATP、dGTP和dCTP各0.5mM,dTTP、dUTP各0.5mM,Tris-HCl 40mM,KCl 10mM,(NH4)2SO4 5mM,MgSO41mM,Triton X-100 0.05％,Betaine 0.8M；溶剂为双蒸水。
气单胞菌阳性DNA制备方法如下：用位于LAMP目标片段上下游的PCR引物(Aeromonas-Pf[SEQ ID NO.5]：5'-GAGGAAAGGTTGGTAGCGAA；Aeromonas-Pr[SEQ ID NO.6]：5'-ACCCCCCTCTACAAGACTC)，对嗜水气单孢菌基因组DNA进行扩增，扩增条件为：96℃预变性5min，96℃变性20s，60℃退火20s，74℃延伸50s完成一个扩增循环，重复循环25轮，最后75℃延伸8min，6℃保存，得到474bp的条带，回收该片段后，将其连接到载体pMD-18 T-Vector，并转化大肠杆菌感受态细胞JM109，经PCR验证后，提取质粒，得到气单胞菌阳性DNA，稀释至100拷贝/μl后作为气单胞菌阳性对照。
实施例四
一种气单胞菌的检测方法，利用实施例一～实施例3的任意一种检测试剂盒，依次进行如下步骤：
1)取待测患病鲫鱼肝脏组织0.2g置于离心管I中，加入研磨液管内的0.5ml研磨液，用研磨棒充分磨碎至浆状，
2)将上述研磨所得的浆状样品煮沸(100℃，l0min)后以10000r/min离心5min，取上清液置于离心管II中；
3)向离心管II内加入核酸提取液A管内的乙酸钠溶液混匀，乙酸钠溶液与上清液的体积比为1：10；再加入-20℃预冷的核酸提取液B管内的无水乙醇混合，静置10min，以12000r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀物，无水乙醇与沉淀物的体积比为2:1；
4)用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤3)所得的沉淀物，然后12000r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀物；
5)用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤4)所得的沉淀物，然后12000r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀物；
6)将上述步骤5)所得的沉淀物(位于离心管II的底部)于室温晾干，加入TE缓冲液管内的20μl TE缓冲液溶解沉淀物，得到样品核酸；
7)分别将上述样品核酸、阴性对照管内的双蒸水、阳性对照核酸管内的阳性对照核酸2μl，加至21μl LAMP反应液中，再加入1μl UNG酶，从而分别得检测管、阴性对照管和阳性对照管；对上述检测管、阴性对照管和阳性对照管均于37℃保温10min进行酶解，目的是以酶解方法消除其中可能存在的污染模板；
8)将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管酶解后的反应体系先于95℃保温5min，然后再迅速置于碎冰块中5min；
9)向步骤8)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管的反应体系中再分别加入1μl Bst DNA聚合酶；
10)将上述步骤9)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管分别进行如下操作：先于64℃保温45min，然后于90℃保温2min完成LAMP反应；
11)LAMP反应结束后，加入1μl核酸染料SYBR Green I，观察检测管内LAMP反应产物的颜色，如果检测管与阳性对照管均显示绿色，阴性对照管显示橙色，表示该样品的气单胞菌检测结果为阳性；如果检测管与阴性对照管均显示橙色，阳性对照管显示绿色，表示该样品的气单胞菌检测结果为阴性；如果阳性对照管显示橙色，表示该检测试剂已失效，需更换检测试剂后重新检测；如果阴性对照管显示绿色，表示该检测试剂已被污染，需更换检测试剂及检测地点后重新检测。
实施例五
一种气单胞菌的检测方法，利用实施例一、二、三的任意一种检测试剂盒，对病样用营养肉汤进行增菌后，按照以下步骤对致病性气单胞菌进行检测：
1)取待测患病鲫鱼鱼肝脏组织2g置于无菌匀浆器中匀浆，将匀浆液加到营养肉汤(5ml)中25℃～28℃摇床培养5h～6h。营养肉汤配方为：蛋白冻10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.4。将上述成分混合、溶解后校正pH，121℃高压灭菌15min；
2)取2ml菌液，10000r/m离心1min，弃上清，加入50μl双蒸水，水浴煮沸10min；
3)10000r/m离心1min，取上清液；
4)使用实施例一～实施例3的任意一种检测试剂盒，按照实施例4中步骤7)～步骤11)所述方法进行检测。
如果检测管显示绿色则表示该样品的气单胞菌检测结果为阳性，若检测管显示橙色则表示该样品的气单胞菌检测结果为阴性。
这个实施例说明可以不用经过相当复杂的DNA模板制备，结果细菌扩增之后只需煮沸即能制备DNA检测模板，说明此方法简便。
实施例六
一种气单胞菌的检测方法，以不同种细菌作为检测对象，验证检测方法的特异性，按照以下步骤对细菌进行检测：
1)将嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、地衣芽孢杆菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、硝化细菌分别于合适培养基中培养富集至OD600＝0.6。
2)取1ml菌液，10000r/m离心1min，弃上清，加入50μl双蒸水，水浴煮沸10min；
3)10000r/m离心1min，取上清液，即得细菌DNA检测模板；
4)使用实施例一～实施例3的任意一种检测试剂盒，按照实施例4中步骤7)～步骤11)所述方法，分别对10-1-10-7模板进行检测。
结果表明，LAMP反应能检测出嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌等致病性气单胞菌，而对地衣芽孢杆菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、硝化细菌等水环境中常见细菌的检测结果呈现阴性。
上述结果说明：本发明的LAMP检测试剂盒对致病性气单胞菌具有很好的特异性。
对比实验1：以同一患病动物样品(已确认感染嗜水气单孢菌)作为待测样品，利用实施例一中的试剂盒，按实施例4中步骤1)～步骤6)的方法制备患病鲫鱼的检测模板(即样品核酸)。将上述模板用TE缓冲液进行10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7倍系列稀释，分别作为LAMP和PCR检测模板。
1)按照实施例4中步骤7)～步骤11)所述方法，分别对10-1-10-7模板进行检查。
2)以同样的模板进行PCR检测，使用引物Aeromonas-Pf和Aeromonas-Pr。
结果表明，LAMP反应能检测到10-6倍稀释的模板，而PCR只能检测至10-3倍稀释的模板，LAMP检测的灵敏度比PCR高1000倍，且用时更少，无需复杂设备。
对比实验2：以同一只患病鲫鱼作为待测样品，利用实施例二中的试剂盒，实验方式同对比实验1。
结果表明：LAMP反应能检测到10-6倍稀释的模板，而PCR只能检测至10-3倍稀释的模板。
对比实验3：以同一只患病鲫鱼作为待测样品，利用实施例三中的试剂盒，实验方式同对比实验1。
结果表明：LAMP反应能检测到10-6倍稀释的模板，而PCR只能检测至10-3倍稀释的模板。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江万里学院
<120> 一种气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒及其检测方法
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