一种气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒及其检测方法与流程

文档序号:11145828阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒,其特征在于,它包括:

1)研磨液管:内装研磨液,

2)核酸提取液A管:内装乙酸钠溶液;

3)核酸提取液B管:内装无水乙醇;

4)核酸提取液C管:内装质量浓度65~75%的乙醇溶液;

5)TE缓冲液管:内装TE缓冲液;

6)UNG酶管:内装尿嘧啶DNA糖基化酶;

7)LAMP反应液管:内装LAMP反应液;

8)Bst DNA聚合酶管:内装Bst DNA聚合酶;

9)显色剂管:内装核酸染料SYBR Green I;

10)阳性对照核酸管:内装气单胞菌阳性DNA;

11)阴性对照管:内装灭菌的双蒸水。

2.根据权利要求1所述的气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒,其特征在于,所述研磨液由以下体积百分数的组分组成:三羟甲基氨基甲烷5~10%、乙二胺四乙酸二钠0.5~2.0%、十二烷基磺酸钠5~10%、巯基乙醇0.01~1.0%、8-羟基喹啉0.01~0.02%、平衡酚5~10%、氯仿5~10%,余量为双蒸水;所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为1~2M;所述乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.25~1.0M;所述十二烷基磺酸钠的质量分数为5~10%。

3.根据权利要求1所述的气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒,其特征在于,所述LAMP反应液由以下浓度的组分组成:LAMP引物Aeromonas-FIP和Aeromonas-BIP各1~4μM,LAMP引物Aeromonas-F3和Aeromonas-B3各0.1~0.5μM,dATP、dGTP和dCTP各0.5~2mM,dTTP、dUTP各0.25~1mM,Tris-HCl 10~40mM,KCl 10~20mM,(NH4)2SO4 5~15mM,MgSO4 1~4mM,Triton X-100 0.05%~1.0%,Betaine0.8~1.2M,溶剂为双蒸水。

4.根据权利要求3所述的气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒,其特征在于,所述LAMP引物Aeromonas-FIP的核酸序列为SEQ ID NO.1。

5.根据权利要求3所述的气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒,其特征在于,所述LAMP引物Aeromonas-BIP的核酸序列为SEQ ID NO.2。

6.根据权利要求3所述的气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒,其特征在于,所述LAMP引物Aeromonas-F3的核酸序列为SEQ ID NO.3。

7.根据权利要求3所述的气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒,其特征在于,所述LAMP引物Aeromonas-B3的核酸序列为SEQ ID NO.4。

8.根据权利要求1所述的气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒,其特征在于,所述气单胞菌阳性DNA通过以下步骤制备:对嗜水气单孢菌基因组DNA进行扩增,即92~96℃预变性5~10min,92~96℃变性20~40s,56~60℃退火20~40s,70~74℃延伸50~70s完成一个扩增循环,重复循环25~35轮,最后70~75℃延伸8~12min,2~6℃保存,得到474bp的条带,得到阳性DNA片段;回收阳性DNA片段,将其连接到载体pMD-18T-Vector,并转化大肠杆菌感受态细胞JM109,经PCR验证后,提取质粒,得到气单胞菌阳性DNA;所述阳性DNA片段的序列为SEQ ID NO.7。

9.一种利用权利要求1~8中任意一种气单胞菌的核酸等温扩增检测试剂盒的气单胞菌的检测方法,其特征在于,它包括下列步骤:

1)取待测样品组织于离心管I中,加入研磨液,用研磨棒充分磨碎至浆状,

2)将上述研磨所得的浆状样品煮沸后以8000~12000r/min离心5~10min,取上清液置于离心管II中;

3)向装有上清液的离心管II内加入核酸提取液A管内的乙酸钠溶液混匀,再加入预冷的核酸提取液B管内的无水乙醇混合,静置5~20min,以10000~14000r/min离心5~10min,弃上清液,保留沉淀物;

4)用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤3)所得的沉淀物,然后10000~14000r/min离心5~10min,弃上清液,保留沉淀物;

5)用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤4)所得的沉淀物,然后10000~14000r/min离心5~10min,弃上清液,保留沉淀物;

6)将上述步骤5)所得的沉淀物于室温晾干,加入TE缓冲液溶解沉淀物,得到样品核酸;

7)分别将上述样品核酸、阴性对照管内的双蒸水、阳性对照核酸管内的阳性对照核酸,加至LAMP反应液中,再加入UNG酶,分别得检测管、阴性对照管和阳性对照管;对上述检测管、阴性对照管和阳性对照管均于36~38℃保温5~20min进行酶解;

8)将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管酶解后的反应体系先于90~100℃保温5~10min,然后再迅速置于碎冰块中;

9)向步骤8)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管的反应体系中再分别加入Bst DNA聚合酶;

10)将上述步骤9)所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管分别进行如下操作:先于63~65℃保温40~50min,然后于85~95℃保温2~5min完成LAMP反应;

11)LAMP反应结束后,加入核酸染料SYBR Green I,观察检测管内LAMP反应产物的颜色。

10.根据权利要求9所述的气单胞菌的检测方法,其特征在于,所述步骤3)中乙酸钠溶液与上清液的体积比为1:12~1:8;所述步骤3)中无水乙醇与沉淀物的体积比为4:1~4:3。

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