一种木质素合成途径中上位性效应检测方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种木质素合成途径中上位性效应检测方法。

背景技术：

上位性效应是指在群体遗传学和数量遗传学中，非等位基因间的遗传效应为非相加性时，他们之间的遗传效应称为上位性效应，也就是位于不同基因座上的基因相互之间产生的非加性的相互作用。研究表明，上位性效应是物种分化、适应性以及杂种优势的重要遗传机制。

木质素(Lignin)是一种广泛存在于植物体中的无定形、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物，其主要存在于植物的木质部中，维持极高的硬度并以此支撑整株植物的重量。木质素主要由三种木质素单体组成，包括p-香豆醇、松柏醇和芥子醇。木质素作为植物体中重要的组成成分，对其合成途径中的分子遗传学效应，尤其是合成途径中上位性效应进行检测，对于木质素的研究具有重大意义，现有技术中并没有关于对木质素上位性效应进行有效检测的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种木质素合成途径中上位性效应检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种木质素合成途径中上位性效应检测方法，包括以

下步骤：

1)根据已知木质素合成通路，选取待测样品中参与合成木质素单体的基因作为目的基因；

2)对所述目的基因进行InDel位点基因型分型，获得待测样品的基因型数据；

3)根据所述待测样品的基因型数据和待测样品的木质素含量，用epiSNP软件计算具有上位性效应的位点；

4)对所述上位性效应位点间的上位性效应的显著性进行检测验证。

优选的，所述待测样品为毛白杨。

优选的，所述目的基因为咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6，PtoCCoAOMT6和4-香豆酸-辅酶A连接酶基因7，Pto4CL7。

优选的，所述步骤2)包括以下步骤：

2.1)根据咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6，PtoCCoAOMT6和4-香豆酸-辅酶A连接酶基因7，Pto4CL7设计引物，以待测样品基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因全长序列，将所述目的基因全长序列进行多重比对，得到InDel位点；

2.2)根据所述InDel位点设计PCR扩增标记引物，所述PCR扩增标记引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用荧光基团修饰；

2.3)用所述PCR扩增标记引物对待测样本基因组DNA进行PCR扩增，用毛细管荧光凝胶电泳检测得到的扩增产物：若扩增产物中有两条条带，则该InDel位点的基因型为杂合型SL；若扩增产物中有一条条带且片段大小与杂合型SL中大的片段相同，则该InDel位点基因型为插入纯合型LL；若扩增产物中有一条条带且片段大小与杂合型SL中小的片段相同，则表示该InDel位点为缺失纯合型SS。

优选的，步骤2.1)所述咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6，PtoCCoAOMT6设计的引物包括4对，序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

优选的，步骤2.1)所述4-香豆酸-辅酶A连接酶基因7，Pto4CL7设计的引物包括6对，序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，以及SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。

优选的，所述InDel位点为两个，分别是位于咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6第3474位碱基的InDel1位点和位于4-香豆酸-辅酶A连接酶基因7第5027位碱基的InDel2位点。

优选的，所述InDel1位点的PCR扩增标记引物的碱基序列为EQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；所述InDel2位点的PCR扩增标记引物的碱基序列为EQ ID NO.23和SEQ ID NO.24。

优选的，所述步骤2)后还包括：将所述步骤2)获得的基因型数据进行筛选，筛选标准为：每个InDel标记位点有三种基因型包括SL、LL和SS，并且最小基因型频率≥5％；每两个InDel标记位点间有九种基因型组合包括SSSS、SSSL、SSLL、SLSS、SLSL、SLLL、LLSS、LLSL和LLLL。

优选的，步骤4)中所述检测验证采用epiSNP软件计算，计算结果P_I和P_value值均≤1.00E-05，说明上位性效应位点间的上位性效应显著。

本发明的有益效果：本发明提供木质素合成途径中上位性效应检测方法，利用InDel位点基因型分型，采用简单的PCR就可以精准、简便的测定木质素合成通路中的上位性效应，实验技术成熟，操作简便，检测通量高，检测结果可靠。

附图说明

图1为实施例1检测的咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因单位点效应箱图；

图2为实施例1检测的4-香豆酸-辅酶A连接酶基因单位点效应箱图；

图3为实施例1检测的咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因和4-香豆酸-辅酶A连接酶基因上位性效应的箱图。

具体实施方式

本发明提供了一种木质素合成途径中上位性效应检测方法，包括以下步骤：1)根据已知木质素合成通路，选取参与合成木质素单体的基因作为目的基因；2)对待测样品目的基因进行InDel位点基因型分型，获得待测样品的基因型数据；3)根据待测样品的基因型数据和待测样品的木质素含量，用epiSNP软件计算目的基因的上位性效应位点；4)对上位性效应位点间的上位性效应的显著性进行检测验证。

在本发明中，所述的木质素合成通路为现有技术文献中公开的木质素合成通路，优选的本发明选取以下文献图一中所述的木质素合成通路：Shi et al.,2010Towards a systems approach for lignin biosynthesis in Populus trichocarpa:transcript abundance and specificity of the monolignol biosynthetic genes.Plant and Cell Physiology 51,144-163。

本发明提供的检测方法适用林木物种，本发明中所述的待测样品优选的为杨木样品，更优选的为毛白杨样品。

本发明选取的目的基因为待测样品木质素合成通路中的任一基因，优选为咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6，PtoCCoAOMT6和4-香豆酸-辅酶A连接酶基因7，Pto4CL7；其中所述咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6，PtoCCoAOMT6的全长序列为SEQ ID No.25，所述4-香豆酸-辅酶A连接酶基因7Pto4CL7的全长序列为SEQ ID No.26。

本发明在选取目的基因后，对待测样品目的基因进行InDel位点基因型分型，获得待测样品的基因型数据；所述InDel位点基因型分型优选包括以下步骤：

2.1)根据咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6，PtoCCoAOMT6和4-香豆酸-辅酶A连接酶基因7，Pto4CL7设计引物，以待测样品基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因全长序列，将所述目的基因全长序列进行多重比对，得到InDel位点；

2.2)根据所述InDel位点设计PCR扩增标记引物，所述PCR扩增标记引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用荧光基团修饰；

2.3)用所述PCR扩增标记引物对待测样本基因组DNA进行PCR扩增，用毛细管荧光凝胶电泳检测得到的扩增产物：若扩增产物中有两条条带，则该InDel位点的基因型为杂合型SL；若扩增产物中有一条条带且片段大小与杂合型SL中大的片段相同，则该InDel位点基因型为插入纯合型LL；若扩增产物中有一条条带且片段大小与杂合型SL中小的片段相同，则表示该InDel位点为缺失纯合型SS。

本发明根据目的基因DNA设计引物，以待测样品基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到目的基因全长序列。在本发明中，根据咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6PtoCCoAOMT6设计的引物包括4对，序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；根据4-香豆酸-辅酶A连接酶基因7Pto4CL7设计的引物包括6对，序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，以及SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。

在本发明中，所述待测样品基因组DNA采用本领域常规的基因组DNA提取方法获得，无其他特殊要求，具体的待测样品基因组DNA用商用DNA提取试剂盒提取。本发明对此处所述PCR扩增相关的技术特征无特殊限定，只要能够扩增得到目的基因全长序列即可。

本发明在得到目的基因全长序列后，本发明将所述目的基因全长序列进行多重比对，得到InDel位点。在本发明中，所述的多重比对优选的采用MEGA软件中的ClustalW模块，具体的多重比对的参数优选的为软件模块中的默认参数。具体的在本发明中获得的InDel位点有两个，分别是位于咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6第3474位碱基的InDel1位点和位于4-香豆酸-辅酶A连接酶基因7第5027位碱基的InDel2位点。

本发明在获得InDel位点后，根据所述InDel位点设计PCR扩增标记引物，所述PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用荧光基团修饰。具体的，在本发明中，根据InDel1位点设计的PCR扩增标记引物中正向引物的碱基序列为EQ ID NO.21，反向引物的碱基序列为SEQ ID NO.22、本发明优选将InDel1位点相应的正向引物SEQ ID NO.21的5'末端采用荧光基团FAM进行修饰；

在本发明中，根据InDel2位点设计的PCR扩增标记引物中正向引物的碱基序列为EQ ID NO.23，反向引物的碱基序列为SEQ ID NO.24。本发明优选将根据InDel2位点设计的正向引物SEQ ID NO.23的5'末端采用荧光基团FAM进行修饰。

本发明获得PCR扩增标记引物后，分别用所述两个InDel位点设计的PCR扩增标记引物对待测样本基因组DNA进行PCR扩增获得不同的扩增产物。在本发明中，所述PCR扩增的条件独立优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53～57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。所述退火温度更优选的为55～56℃。在本发明中，所述PCR扩增用扩增体系独立优选包括以下组分：0.7μl的待测样本基因组DNA，0.15μl的0.8UTaq酶，0.3μl 0.2mM的dNTPs，0.9μl 25mM的MgCl2，1.25μl的10×PCR buffer，0.4μl 100nmolL^-1的正向引物和0.4μl 100nmolL^-1反向引物和8.4μl的ddH₂O。

本发明在获得扩增产物后，用毛细管荧光凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中有两条条带则该InDel位点的基因型为杂合型SL；若扩增产物中有一条条带且片段大小与杂合型ID中大的片段相同，则该InDel位点基因型为插入纯合型LL；若扩增产物中有一条条带且片段大小与杂合型ID中小的片段相同，则表示该InDel位点为缺失纯合型SS。根据毛细管荧光凝胶电泳检测结果获得待测样品的基因型数据。

本发明在获得待测样品的基因型数据，为了更好地分析上位性效应，优选对所得到的待测样品基因型数据进行筛选，筛选标准为待测样品中每个InDel标记位点有种基因型包括SL、LL和SS，并且占比最小的基因型频率≥5％；每两个InDel标记位点间有九种基因型组合包括SSSS、SSSL、SSLL、SLSS、SLSL、SLLL、LLSS、LLSL和LLLL，将不满足条件的数据舍弃。

本发明将得到的待测样品的基因型数据和待测样品的木质素含量，用epiSNP软件计算目的基因上位性效应位点。计算结果P_I和P_value值均≤1.00E-05，认为上位性效应位点间的上位性效应显著。

在本发明中，所述木质素含量的测定方法包括以下步骤：

1)将待测样品的木材烘干后打磨成木粉，依次通过40目和60目的筛子后获得待测木材的木粉；2)采用近红外光谱仪漫反射对样品的近红外光谱进行采集；3)对原始光谱进行校正处理后建立相应的木质素含量测定模型，获得每个待测样品的木质素含量。

具体的本发明将待测样品木材打磨成木粉依次过40目和60目的筛子获得待测木质素样品，优选的在本发明中木材打磨成粉采用木粉机进行；本发明在获得待测木质素样品后，采用近红外反射光谱测定获得木质素百分含量，所述近红外反射光谱测定木质素的具体步骤和参数没有特殊限定，采用本领域常规的近红外反射光谱测定方法即可。本发明中测得的每个个体的木质素百分含量在7.53％到28.68％之间。

本发明在获得木质素含量后，将筛选后待测样品的基因型数据和待测样品的木质素含量输入到epiSNP软件，用epiSNP软件计算目的基因上位性效应位点，具体的采用epiSNP软件中上位性效应计算程序的默认参数进行计算，获得具有上位性效应的位点。

本发明在获得具有上位性效应位点后，为了避免出现假阳性或假阴性的结果，优选对得到的上位性效应位点间的上位性效应的显著性进行检测验证。所述检测验证优选具体为：分别将InDel1位点和InDel2位点所对应的三种基因型个体SL、LL和SS进行分组，然后利用SPSS软件对分组间的木质素含量进行箱图分析；然后将InDel1位点和InDel2位点之间的九种联合基因型个体(SSSS、SSSL、SSLL、SLSS、SLSL、SLLL、LLSS、LLSL和LLLL)进行分组，利用SPSS软件对这九个分组间的木质素含量进行箱图分析；根据每个位点单独分析的木质素含量箱图结果和两个位点之间联合分析的木质素含量箱图结果判定上位性效应位点间的上位性效应的显著性。如果每个位点单独分析的木质素含量箱图结果和两个位点之间联合分析的木质素含量箱图结果一致，则说明两个位点间无显著的上位性效应，如果不一致，则说明两个位点间有显著的上位性效应。

下面结合实施例对本发明提供的木质素合成途径中上位性效应检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

材料取自山东冠县毛白杨基因库(全国毛白杨种质资源库)中435株个体。

根据已有的文献Shi et al.,2010Towards a systems approach for lignin biosynthesis in Populus trichocarpa:transcript abundance and specificity of the monolignol biosynthetic genes.Plant and Cell Physiology 51,144-163.，选取木本植物中木质素合成通路中的两个基因，咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6PtoCCoAOMT6和4-香豆酸：辅酶A连接酶基因7Pto4CL7作为目的基因；

根据咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6在毛果杨数据库中的DNA序列设计4对引物，引物对序列分别为SEQ ID NO.1(CCoAOMT1F:5'-CGCCGGACTTGAAATCGAAA-3')和SEQ ID NO.2(CCoAOMT1R:5'-GCATGCCTCACTGAACCAAA-3')、SEQ ID NO.3(CCoAOMT2F:5'-TTGGATTTTGCCCTTCCTGC-3')和SEQ ID NO.4(CCoAOMT2R:5'-ACCATCAACCCTAACCTGCA-3')、SEQ ID NO.5(CCoAOMT3F:5'-TTTGGTTCAGTGAGGCATGC-3')和SEQ ID NO.6(CCoAOMT3R:5'-CGGGCACATCAATACCGTTT-3')以及SEQ ID NO.7(CCoAOMT4F:5'-CCCGAGGAAAAGGTGCAATT-3')和SEQ ID NO.8(CCoAOMT4R:5'-GCCACATCCCTCACTGCTAT-3')；根据香豆酸：辅酶A连接酶基因7在毛果杨数据库中的DNA序列设计6对引物，引物对序列分别为SEQ ID NO.9(4CL 1F:5'-GAGTGACGACCTGTGCATAA-3')和SEQ ID NO.10(4CL 1R:5'-AGGAGATGAAGGTGGTGACG-3')、SEQ ID NO.11(4CL 2F:5'-CTTCATCTCCTCCCGTCCTC-3')和SEQ ID NO.12(4CL 2R:5'-ATAGCCCTGCCGTACCATAC-3')、SEQ ID NO.13(4CL 3F:5'-ACCGGGCCACTTATTTACCA-3')和SEQ ID NO.14(4CL 3R:5'-GATTGAAATGCCGACCTCCC-3')、SEQ ID NO.15(4CL 4F:5'-GAGGTCGGCATTTCAATCCC-3')和SEQ ID NO.16(4CL 4R:5'-GCAATGCCTCTAGTTCTGCC-3')、SEQ ID NO.17(4CL5F:5'-GTTGTAGATGCAGCGAGTGG-3')和SEQ ID NO.18(4CL 5R:5'-ACAGACTACCCAATGACGCA-3')、SEQ ID NO.19(4CL5F:5'-GGAGGAGCAGGCGTACATAT-3')和SEQ ID NO.20(4CL 5R:5'-TCAAGCGAAGAGAAACCAACTG-3')；其中，每对引物扩增片段长度不超过2000bp。

从毛白杨基因库中435株个体中按照地域分布，随机挑选45株个体的DNA作为模板进行扩增，将获得的扩增产物进行测序和序列拼接，获得45株毛白杨的咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6和香豆酸：辅酶A连接酶基因7的基因序列全长。

利用MEGA软件中的ClustalW程序针对上述毛白杨咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6和香豆酸：辅酶A连接酶基因7的序列进行多重比对，确定待测InDel位点；InDel1标记位点位于咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6第3474位碱基；InDel2标记位点位于4-香豆酸：辅酶A连接酶基因7第5027位碱基。

针对InDel1位点(黑体下划线标注)，整个自然群体包含两种类型的DNA模板链，其中模板链I:5'-AAAAATATTTTCACCATGTATTT-NNNNNNNNNNNN-3'，模板链II:5'-AAAAATATTTTCACCATGTATTTNNNNNNNNNNNN-3'。对应的InDel位点分别为S(deletion)和L(insertion)。设计合成一条5'末端用FAM荧光基团进行修饰的正向引物：SEQ ID NO.21(CCoAOMT6ID1F:5'-ATGGTGGCATGGTGAAAAAT-3')和一条正常的不进行荧光修饰的反向引物SEQ ID NO.22(CCoAOMT6ID1R:5'-TGGTGTTCAAAGCAGTCAGC-3')，采用毛白杨基因库435株个体的DNA进行PCR扩增。

针对InDel2位点(黑体下划线标注)，整个自然群体包含两种类型的DNA模板链，其中模板链I:5'-TCTTCGGTTTACAGGTGGTGTCAAAAAAAATTTT-NNNNNNNNNNNN-3'，模板链II:5'-TCTTCGGTTTACAGGTGGTGTCAAAAAAAATTTTNNNNNNNNNNNN-3'。对应的InDel位点分别为S(deletion)和L(insertion)。设计合成一条5'末端用FAM荧光基团进行修饰的正向引物：SEQ ID NO.23(4CL7ID1F:5'-ATCTACGATCAACTTGTGTCTGA-3')和一条正常的不进行荧光修饰的反向引物SEQ ID NO.24(4CL7ID1R:5'-TATCTTGCCAAATTAAATCAC-3')，采用毛白杨基因库435株个体的DNA进行PCR扩增。PCR扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53～57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增用扩增体系包括以下组分：0.7μl的12ng/μl待测样品基因组DNA，0.15μl的0.8UTaq酶，0.3μl 0.2mM的dNTPs，0.9μl 25mM的MgCl2，1.25μl的10×PCR buffer，0.4μl 100nmolL^-1的正向引物和0.4μl100nmolL^-1反向引物和8.4μl的ddH₂O。

将PCR扩增的产物进行毛细管荧光凝胶电泳检测，若扩增产物中有两条条带则该InDel位点的基因型为杂合型SL；若有一条条带且片段大小与杂合型ID中大的片段相同，则该InDel位点基因型为插入纯合型LL；若有一条条带且片段大小与杂合型ID中小的片段相同，则表示该InDel位点为缺失纯合型SS。根据毛细管荧光凝胶电泳检测的结果获得毛白杨基因库435株个体在InDel1位点和InDel2位点的基因型数据。

测定毛白杨基因库中435株个体的木质素含量，用木粉机将木材打磨成木粉，依次通过40目和60目的筛子筛选后，用近红外反射光谱测定获得每个个体的木质素含量在7.53％到28.68％之间。经筛选，上述InDel1和InDel2位点均具有三种基因型且最小基因型频率≥5％，位点间具有九种基因型组合。利用epiSNP软件，结合上述步骤中的InDel1和InDel2位点的基因型数据和木质素含量数据，利用epiSNP软件进行上位性效应分析。

经epiSNP软件计算获得，InDel1和InDel2位点的P_I和P_value值均≤1.00E-05，说明上述InDel1和InDel2位点之间对木质素含量具有显著的加性×加性的上位性效应。

然后分别对咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6，PtoCCoAOMT6中的InDel1位点的三种基因型效应、香豆酸：辅酶A连接酶基因7，Pto4CL7中的InDel2位点的三种基因型效应以及InDel1位点和InDel2位点之间的九种联合基因型效应进行木质素含量的上位性效应检测。将咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6PtoCCoAOMT6中的InDel1位点所对应的三种基因型个体进行分组，利用SPSS软件对这三个分组间的木质素含量进行箱图分析；将香豆酸：辅酶A连接酶基因7Pto4CL7中的InDel2位点所对应的三种基因型的个体进行分组，利用SPSS软件对这三个分组间的木质素含量进行箱图分析；将InDel1位点和InDel2位点之间的九种联合基因型个体进行分组，利用SPSS软件对这九个分组间的木质素含量进行箱图分析，结果如图1、2和图3所示。由附图可知，当只考虑单位点的基因型效应时，木质素的含量在咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6和香豆酸：辅酶A连接酶基因7的三种基因型之间并没有显著的差异；但当考虑上位性效应时，木质素的含量在两个位点的九种联合基因型之间具有显著的差异，其中当咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6的基因型为SS而香豆酸：辅酶A连接酶基因7的基因型为LL时，木质素的含量最高；当咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6的基因型为LL而香豆酸：辅酶A连接酶基因7的基因型为LL时，木质素的含量最低。由此可知咖啡酰-辅酶A甲基转移酶基因6和香豆酸：辅酶A连接酶基因7之间产生了非加性的上位性效应。

由以上实施例可知，本发明提供木质素合成途径中上位性效应检测方法，利用InDel位点基因型分型，采用简单的PCR就可以精准、简便的测定木质素合成通路中的上位性效应，实验技术成熟，操作简便；在进行上位性检测时，可以同时对多个基因的多个位点进行上位性检测，不仅局限于实施例中的两个基因内的两个位点，因此，本发明具有较高的检测通量；而对检测出具有上位性效应的单个位点的三个分组以及位点之间的九种联合基因型分组间的木质素含量进行箱图分析可知，检测出的位点间的上位性效应显著，因此，检测结果可靠。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。