一种降低木质素含量的代谢途径改造方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体而言是一种通过在植物中构建2-苯乙醇合成通路以降低木质素合成，进而提高纤维生物质转化效率的方法与应用。2-苯乙醇合成通路来自酵母，包含三个关键基因，分别是氨基酸转氨酶基因AR09，丙酮酸脱羧酶基因他饵卩乙醇脱氢酶基因ADH2。本发明在拟南芥中构建一条2-苯乙醇合成的途径，通过2-苯乙醇的合成与木质素合成竞争起始底物苯丙氨酸，引起碳代谢的分流，实现转基因植物中木质素合成减少。本发明主要的目的是通过降低植物中木质素合成，从而降低纤维生物质预处理的难度。目前，在拟南芥中本方法已表现出降低木质素合成，同时提高茎秆细胞壁提取物酶解释放葡萄糖效率的特性。
【专利说明】一种降低木质素含量的代谢途径改造方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体而言是一种通过在转基因植物中构建2-苯乙醇 合成通路以降低木质素合成的方法和应用。
【背景技术】
[0002] 木质纤维生物质（biomass)是地球上最丰富的可再生资源。其转化产品丰富，可 转化为生物燃料及生物基化学品等多种产品。随着矿物资源的日益短缺，以及使用石油等 矿物资源所带来的环境污染和气候恶化，纤维生物质资源的开发利用已在世界范围内引起 了广泛的关注。木质素是木质纤维生物质的主要成分之一，其存在一直是限制纤维生物质 高效转化利用的主要屏障。以前的研究结果证明，通过基因工程技术改变能源植物木质素 的含量和成分能够显著降低原材料预处理强度，同时提高纤维素的降解效率和生物乙醇的 发酵产量。因此，开发高效转化利用的新型纤维生物质能源植物是解决生物质利用困难的 关键瓶颈之一，具有重要的应用价值。
[0003] 木质素（lignin)是高等植物细胞壁的重要组分，是一类组成和结构十分复杂的 芳香类聚合物,主要有H-木质素、S-木质素和G-木质素3种主要的木质素类型。木质素的 合成代谢途径在双子叶植物中被广泛深入地研究。其生物合成以苯丙氨酸为起始底物，进 入苯丙酸途径，经过一系列反应合成羟基肉桂酸类化合物，最终生成3种主要木质素单体。 目前，国内外关于木质素合成途径和遗传调控的研究，主要集中于双子叶植物。木质素单 体合成途径的 10 个酶基因（PAL、C4H、HCT、C3H、CES、4CL、CCoAOMT、CCR、F5H、COMT 和 CAD) 的功能在拟南芥中已经基本研究清楚，其中许多关键基因已应用于植物木质素生物合成调 控。
[0004] 目前的植物木质素基因工程的研究策略主要是通过调控木质素合成关键基因的 表达来实现木质素含量的降低或组成结构的改变，从而使木质素更易于去除，进而利于纤 维生物质的转化利用。为了给木质素分子改良提供更多选择和策略，本发明以木质素合成 的起始底物苯丙氨酸为切入点，在拟南芥中构建一条2-苯乙醇合成的途径，希望通过2-苯 乙醇的合成与木质素合成竞争起始底物苯丙氨酸，引起碳代谢的分流，实现转基因植物中 木质素合成的减少。
[0005] 2-苯乙醇是一种具有玫瑰花香的芳香醇，作为香料广泛应用于日化、轻工和食品 等领域。其合成途径在酿酒酵母都得到了较深入的研究，植物中2-苯乙醇合成研究相对较 少，在植物中存在三条不同途径。与木质素合成相似，酵母中2-苯乙醇的合成都是以苯丙 氨酸作为起始底物。目前在拟南芥中，尚未有2-苯乙醇合成的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种通过在植物中构建一条2-苯乙醇合成通路，与木质素合成 竞争底物苯丙氨酸，从而降低植物木质素含量的代谢途径改造方法及应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为： 一种2-苯乙醇合成通路，其特征在于：所述合成通路来自酵母，包含三个关键基因， 分别是氨基酸转氨酶基因沒（GenBank序列号：NM_001179267)，丙酮酸脱羧酶基因 必(NM_001180688)和乙醇脱氢酶基因也说？(匪_001182812)。
[0008] -种2-苯乙醇合成通路应用，其特征在于：所述2-苯乙醇合成通路在降低植物茎 杆木质素含量以提高纤维生物质转化效率的应用。
[0009] -种2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，其特征在于：所述合成通路的植物表达 载体包含两个，一个包含WP你和两个基因，另一个包含也说？基因，二者分别具有组 成型启动子。
[0010] 所述两个载体的T-DNA区中还分别包含不同的用于筛选转基因植物的标记基因。
[0011] 所述组成型启动子分别为CaMV35S启动子和pROLD启动子。
[0012] 所述2-苯乙醇合成通路分别为必微、和也说？基因。
[0013] 所述植物为纤维类能源植物。
[0014] 所述植物表达载体在降低植物茎杆木质素含量以提高纤维生物质转化效率的应 用。
[0015] 本发明所具有的优点： 本发明构建了 2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，包含用所述载体转化的拟南芥，以 及在拟南芥中降低木质素合成的方法。而利用本发明描述的方法对拟南芥木质素合成进行 系统的代谢工程改造，使得植物木质素含量下降约11%，茎杆细胞壁提取物酶解释放葡萄糖 效率显著提高，同时对转基因植株的正常生长没有影响，其具有较大的研究价值和应用潜 力。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为本发明实施例提供的2-苯乙醇合成通路的植物表达载体的构建示意图。
[0017] 图2为本发明实施例提供的转化2-苯乙醇合成通路的拟南芥转基因植株。其中， 对照（Control)为转入空载体的转基因拟南芥。
[0018] 图3为本发明实施例提供的RT-PCR分析AWUTtWO和如/--基因在转基因拟南 芥中的表达水平示意图。其中，对照（Control)为转入空载体的转基因拟南芥；1，2,3,4和 5代表为转基因拟南芥株系。拟南芥基因用作内参。
[0019] 图4为本发明实施例提供的转化2-苯乙醇合成通路的拟南芥转基因植株茎横 切面的木质素间苯三酚染色分析。其中，对照（Control)为转入空载体的转基因拟南芥； 4?投为AWUTtWO和也说？基因过表达株系。Bar = 200 Mm。
[0020] 图5为本发明实施例提供的转化2-苯乙醇合成通路的拟南芥转基因植株茎木质 素含量测定。其中，对照（Control)为转入空载体的转基因拟南芥4--制你为 AWUTtWP和也说？基因过表达株系。*表示差异显著（P〈 0.05)。
[0021] 图6为本发明实施例提供的纤维素酶水解拟南芥茎细胞壁提取物的效率分析。其 中，对照（Control)为转入空载体的转基因拟南芥;^放投为和 也说？基因过表达株系。
【具体实施方式】
[0022] 本实验所涉及的药品均购自Sigma公司、Fermentas公司、Thermo Fisher公司、上 海生工公司。具体实验操作依据《分子克隆》。
[0023] 实施例1 2-苯乙醇合成通路的植物表达载体的构建： 1.酵母2-苯乙醇合成通路基因d放沒、必和也说？基因的克隆 为了在植物中构建2-苯乙醇合成通路，根据酿酒酵母中2-苯乙醇合成通路的报道，选 择沒(NM_001179267)、^tWi?(NM_001180688)和也说？(匪_001182812)构建 2-苯乙醇合 成通路。取酿酒酵母cererisiae )提取其基因组DNA，搜索GenBank获得 二者的全长cDNA序列，分别设计基因特异引物，利用PCR技术扩增三者的基因全长cDNA; 最后将二者连入PMD19-T中测序。扩增条件为：95°C 5 min预变性；94 30 s，55 °C 40s， 72 °C I min，35个循环；72 °C 8 min片段延伸。扩增引物为： AR09cDNAF: 5, -ATGACTGCTGGTTCTGCCCCCCCT- 3,； AR09cDNAR: 5' -TCAACTTTTATAGTTGTCAAAAAAT-3' ； AROlOcDNAF: 5' -ATGGCACCTGTTACAATTGAAAAG- 3' ； AROlOcDNAR: 5' -CTATTTTTTATTTCTTTTAAGTGCCG-3' ； ADH2cDNAF: 5' -ATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAG- 3' ； ADH2cDNAR: 5' -TTATTTAGAAGTGTCAACAACGTAT-3'。
[0024] 2. 2-苯乙醇合成通路的植物表达载体的构建 先将狀和也说？基因全长cDNA分别连接到入门克隆pEN-L4-2-L3、pGWC-T和 pGWC-T载体中，测序正确后，利用Gateway技术（Invitrogen公司说明书)，通过基因重组将 必微和必WO插入到pK7m34GW2-8m21GW3载体中，将灿/--基因插入到PH2GW7载体中，从 而得到含有4?沒和必基因共同过表达，及也说？过表达的植物表达载体(参见图1); 实施例2构建2-苯乙醇合成通路降低植物木质素含量的应用： 1.农杆菌介导转化拟南芥 将WP你和共同过表达的植物表达载体转化农杆菌，挑取鉴定阳性的克隆，过夜 培养，至〇D=2.0。将过夜培养的300ml菌液室温离心收菌，并用150ml转化Buffer重悬(转 化Buffer :含0. 5%蔗糖溶液和0. 02% SiIwet)。将拟南芥花序倒置浸入菌液中，尽量使全 部的花序都浸入菌液中，反复浸入5-6次，然后将拟南芥倒放于接水盘中，用保鲜膜覆盖， 于培养间（22°C)过夜，然后正常培养。转化一周以后，可以再重新转化一次，常规管理至种 子成熟。种子收获后，自然晾干，经表面消毒，铺于含有25Pg/ml的卡那霉素的1/2MS平板 上，筛选阳性植株。筛选获得WP你和共同过表达的阳性植株后，经过筛选得到T2代 植株后，再转化也说？过表达的植物表达载体，种子收获后，于含有25Pg/ml的卡那霉素和 25Pg/ml的潮霉素的1/2MS平板上，筛选得到沒、及也说？共同过表达的转基因植 株(参见图2)。
[0025] 2.转基因植株分子鉴定 取生长4周的候选转基因拟南芥叶片，利用CTAB法提取其总RNA，用DNAase I (Sigma 公司）去除可能污染的基因组DNA，然后利用反转录试剂盒（Fermentas公司）反转录成第一 链 cDNA。以 AR09cDNAF/R、AR010cDNAF/R 和 ADH2cDNAF/R 为引物，利用 RT-PCR 法检测其 相对于对照植株(转化pK7m34GW2-8m21GW3空载体)的表达水平。扩增条件为：95 °C 5 min 预变性；94 30 s, 55 °C 40s, 72 °C I min, 28个循环；72 °C 8 min片段延伸。拟南芥 基因用作内参。结果如图3所示，5个代表性转基因植株中AWUTtWP及基 因的表达量比对照植株明显要高，表明这两个基因已经整合到转基因植株中，初步实现了 2-苯乙醇合成通路构建。
[0026] 3.利用乙酰溴法测定转基因植株茎杆木质素的含量。具体步骤为： (1) 材料的选取及细胞壁成分提取：收集7-8周左右的对照及转基因植株的基部茎 (地上部分约5cm)，将材料冻干后研磨成细粉，使用70%的乙醇抽提3次，沉淀再用氯仿-甲 醇抽提1次，沉淀使用丙酮悬浮后吹干，称重，最后再碾磨成细粉； (2) 取约2mg细胞壁提取物，加入乙酰溴溶液，50°C反应3h，冷却至室温，再 加入氢氧化钠和新配置的盐酸羟胺溶液，用冰醋酸调整体积至2ml，取20〇μ1测定 280nm的吸光度，使用下列公式计算木质素含量：木质素含量（%) =ABSL*2ml*100%/ Coeff*0. 539cm*weight(mg) ;ABSL :吸光度，Coeff=15. 69。
[0027] 4.利用石蜡切片观察转基因拟南芥茎木质素含量变化。具体步骤为： (1) 材料的选取及固定：利用锋利刀片取6个月植株茎基部0.5 cm，置于4%多聚甲 醛固定液中真空抽气2 h,直到材料沉于管底，4°C过夜； (2) 脱水及透明：将上述过夜处理的植株茎基部用1倍PBS清洗一次，乙醇梯度脱水 [乙醇梯度比例为10%、30%、50%、80%、90%乙醇(体积百分比)]后，利用无水乙醇（A)和二甲 苯⑶按比例进行浸透，其体积比例分别为A/B=3/l，A/B=l/1，A/B=l/3和B，每步渗透约 Ih; (3) 浸蜡及包埋：渗透处理后利用二甲苯（B)和石蜡（C)按比例进行蜡浸，其体积比例 分别为B/C=3/l，B/C=l/1，B/C=l/3和C，每步浸蜡约3 h，而后62°C烘箱中进行； (4) 切片、展片及烘片：利用LeicaRM2235切片机（Leica公司）将材料切成8 μ m的 薄片，置于42°C水浴锅中展片1-2 min，使之吸附于世泰REF188105粘附载玻片（世泰公 司）上，37°C烘片2天； (5) 脱蜡、二甲苯及染色：将附着有材料的载玻片置于二甲苯中脱蜡5min，脱蜡后， 利用无水乙醇（A)和二甲苯（B)按比例进行梯度洗脱脱水，梯度比例为：A(无水乙醇）/ B(二甲苯）=1/1, A, 95 %A, 85 % A, 75 % A, 50 % A, 30 % A(体积百分比），最后在0.5 % TBO染液中染色15 s ; (6)脱水及封片：将清水洗过的玻片依次在30 % A，50 % A，75 % A，85 % A，95 % A，A及B中脱水至二甲苯中，每步30 s，随后利用加拿大树胶将其封存； (7)切片的观察：利用OLYMPUS DX51光学显微镜（Olympus公司）进行观察，拍照(参 见图4)。
[0028] 实施例3构建2-苯乙醇合成通路提高植物细胞壁酶解糖化效率的应用 利用纤维素酶水解拟南芥茎细胞壁提取物的效率分析。具体步骤为： (1)将细胞壁提取物分为两个处理组，第一组直接使用纤维素酶（Cellulose)和葡萄 糖苷酶（β -glucosidase)处理，分别取对照和转基因植株细胞壁提取物lOOmg，在50 C、 PH4. 8条件下处理24小时，分别于1，3, 6, 24小时取酶解产物50〇μ1，测定水解产物中葡萄 糖含量。
[0029] (2)第二组取细胞壁提取物首先使用热水（12ΓΟ处理1小时，然后使用纤维素 酶和葡萄糖苷酶处理分别于1，3, 6, 24小时取样测定酶解产物中葡萄糖含量。按照葡萄糖 测定试剂盒（氧化酶法）说明书操作，计算发酵样品中葡萄糖含量。
【权利要求】
1. 一种2-苯乙醇合成通路，其特征在于：所述合成通路来自酵母，包含三个关键基因， 分别是氨基酸转氨酶基因你，丙酮酸脱羧酶基因川和乙醇脱氢酶基因也说?。
2. -种权利要求1所述的2-苯乙醇合成通路的应用，其特征在于：所述2合成通路在 降低植物茎杆木质素含量以提高纤维生物质转化效率的应用。
3. -种2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，其特征在于：所述合成通路的植物表达载 体包含两个，一个包含AR09和AROlO两个基因，另一个包含ADH2基因，二者分别具有组成 型启动子。
4. 按权利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，其特征在于：所述两个载 体还分别包含不同的用于筛选转基因植株的标记基因。
5. 按权利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，其特征在于：所述组成型 启动子分别为CaMV35S启动子和pROLD启动子。
6. 按权利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，其特征在于：所述合成通 路关键基因分别为AR09、AR010和ADH2基因。
7. -种权利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表达载体的应用，其特征在于：所 述植物为纤维类能源植物。
8. -种权利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表达载体的应用，其特征在于：所 述植物表达载体在降低植物茎杆木质素含量中的应用。
【文档编号】C12N1/19GK104212731SQ201410170692
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年4月26日 优先权日:2014年4月26日
【发明者】周功克, 祁广, 柴国华, 孔英珍, 王殿, 唐贤丰, 胡瑞波 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所