专利名称：：毛白杨木质素单体合成基因4-cl及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种毛白杨木质素单体合成基因4-CL序列，同时本发明还涉及这种木质素单体合成基因4-CL在甘蓝型油菜中的用途。
背景技术：
：木质素作为植物体内一类复杂的苯丙垸类聚合物，是植物机械组织和细胞壁的主要成分之一，在植物生长发育和抗逆性方面具有重要的作用。在细胞壁木质化过程中，木质素渗入到细胞壁中，填充于细胞壁架构内，增强了细胞壁的硬度，强化了细胞的机械支持力和抗压强度。在与病原菌相互作用中，寄主细胞壁木质化是抗病反应的特征之一，木质素作为植物体内一种重要的物理抗菌物质，能够沉积于细胞壁中富含羟脯氨酸的糖蛋白(服GP)上，作为结构屏障，加固细胞壁,保护细胞免受病原菌的侵染。近年来，突变体及通过转基因植物对木质素生物合成调控的研究主要表现在3个层次一是苯丙氨酸途径上的调控，涉及3种酶PAL(phenylalanineammonia陽lyase)、C4H(cinnamate4-hydroxylase)禾口4-CL(4陽coumarate:CoAligase)，它们的表达决定木质素总量；二是木质素特异合成途径上的调控，主要集中于3种酶，艮卩C0MT(caffeicacidO-methyltransferase)、CCoA0MT(caffeoyl-CoAO-methyltransferase)和F5H(ferulate5-hydroxylase)，这些酶类的表达对木质素含量尤其木质素单体的特异合成影响较大，决定了各种单体在木质素总量中的比例；三是对木质素特异合成途径下游酶类的调控，包括两种还原酶CAD(cinnamylalcoholdehydrogenase)和CCR(cinnamoyl-CoAreductase)，它们负责将各禾中轻基肉桂酰-辅酶A(CoA)酯最终还原成各种木质素单体。苯丙氨酸途径是植物三大次生代谢途径之一。植物的许多重要次生代谢产物均由该途径而来。如木质素、类黄酮、花青素、植保素、酚类物质、信号分子等。该途径由PAL、C4H、4-CL三个酶组成，其中4-CL负责催化肉桂酸及其衍生物生成相应的辅酶A酯，活化后的底物再进入各种不同的代谢途径，参与各种下游次生产物的合成。由于4-CL在苯丙氨酸途径中处于代谢分支点的位置，是木质素单体合成途径中的关键酶，因此被认为是调控木质素合成的理想耙基因。目前有关4-CL调控的研究大多是通过反义RNA技术降低植物内源4-CL活性水平，从而达到降低木质素含量，提高林木的造纸品质和牧草的饲用价值，而利用4-CL的过量表达以提高植物木质素含量、增强植物抵抗逆境能力方面的研究则未见报导。虽然目前从各种植物中分离到的编码4-CL蛋白的基因或cDNA很多，但在本发明申请之前，国内没有人公开或发表过毛白杨木质素单体合成基因4-CL基因序列及其在甘蓝型油菜中的用途。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种毛白杨木质素单体合成基因4-CL。该基因是调控木质素总量合成的关键基因，负责催化各种肉桂酸及其衍生物生成相应的辅酶A酉旨，参与各种下游次生产物的合成，进而提高木质素总量，增强植物抵抗病原物的侵染。本发明的另一个目的是在于提供了一种毛白杨木质素单体合成基因4-CL在油菜抗菌核病中的应用。本发明的再一个目的是在于提供了一种毛白杨木质素单体合成基因4-CL在油菜抗倒伏中的应用为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施毛白杨木质素单体合成基因4-CL的获得1)在NCBI数据库中检索已发表的杨树4-CL基因序列，用01igo6.0软件(通过商业途径市场购买获得，下同)设计基因编码序列的两侧引物(正向引物[5'-ATGAATCCACMGAAGMTTCATC-3，];反向弓l物[5，-TTATATGCCTGCCAACTTTTCTTTCAG-3，])。2)以cDNA第一链为模板进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得4-CL基因序列，一种DNA分子，其碱基序列如SEQIDN0:1所示。通过上述方法获得了毛白杨木质素单体合成基因4-CL，采用一种提高4-CL基因表达活性的转基因油菜，其特征在于转基因植物表现为木质素含量增加，比受体对照(非转基因植株)木质素含量增加10%以上，抗菌核病和抗倒伏能力提高，转基因植株比受体对照(非转基因植株)病斑扩展面积变小30%左右，茎杆强度则比对照(非转基因植株)增强在20%左右。在本发明中为了达到上述目的采用以下技术方法，提供了一种质粒表达载体pBI121(从商业途径获得，下同)，它含有特异表达启动子(木质部特异表达的C4H启动子)和翻译控制件。在本发明的另一个方面，提供了一种可在植物中表达的宿主菌，本发明优选的是农杆菌，更优选的是根癌农杆菌LBA4404(从商业途径获得，中国科学院遗传与发育研究所购置，下同)。本发明也提供了一种将所述载体导入植物细胞的方法，如基因枪注射法，细菌导入法。本发明优选农杆菌导入法，如农杆菌LBA4404油菜子叶柄导入法。本发明提供了一种能够过量表达毛白杨4一CL基因的转基因油菜的方法，其特征在于油菜木质素含量增加，抗菌核病和抗倒伏能力增强。该方法包括下列步骤1)将克隆得到的毛白杨木质素单体合成基因4一CL连接到质粒pBI121上，利用木质部特异表达的C4H启动子形成可转化或表达的载体(pBI121-C4H:4CL);2)将步骤1)中制备的载体(pBI121-C4H:4CL)转入根癌农杆菌LBA4404，再导入甘蓝型油菜植株中；3)筛选阳性植株。在本发明中，①以中国特有树种毛白杨，根据已发表的杨树4一CL基因的保守序列，在基因编码序列的两侧保守区域设计特异引物进行RT-PCR扩增，得到了基因序列如SEQIDN0:1所示。用HindlII/BamHI分别双酶切C4H启动子PCR产物和PBI121质粒，将PCR酶切片段和PBI121质粒酶切大片段连接后，转化到感受态细胞DH5ct(从商业途径获得)中扩增，然后再将4-CL基因引入到载体PBI121中，并取代PBI121中原有的GUS序列，而载体中的35S启动子序列则被C4H启动子序列所取代，构建植物表达载体重新命名为pBI-C4H:4,tCL。②袼含有4-CL基因的载体转染根癌农杆菌LBA4404，培养农杆菌于YEP液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，氯化钠5g)，并将无菌苗在农杆菌菌液中浸泡。③在加卡那(Kan)的选择培养基筛选阳性克隆。在本发明的一个具体实施例中，植株无菌苗选自油菜，通过选择培养基最后筛选到油菜木质素单体合成基因4-CL表达的植株，植株表现出木质素含量增加10%以上，抗倒伏能力和抗菌核病分别提高20%和30%左右。本发明中所用的术语"转基因植物"是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。本发明中的"植物细胞"是指植物的各种未成熟胚，愈伤组织或悬浮细胞(成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶)，或原生质体(叶肉细胞)。这些植物细胞在适当的条件下均能再生成植物。克隆本发明中所述的毛白杨木质素单体合成基因4-CL的方法是本领域中所常采用的方法。提取raRNA的方法也有多种成熟的技术(如采用TRIzolReagent,Invetrogen),提取mRNA试剂盒如可从商业途径获得，而构建cDNA文库也是常用的分子生物学技术。构建本发明中所述的载体和将载体转染入植株也是本领域中所常采用的方法。其中所涉及的质粒(如质粒表达载体pBI121)，转染用媒体(如根癌农杆菌LBA44040和所用试剂)可从商业途径获得。本发明是国内首次公开毛白杨木质素单体合成基因4一CL序列，木质素单体合成基因4一CL在苯丙氨酸途径中处于代谢分支点的位置，是木质素单体合成途径中的关键酶，是调控木质素合成的理想靶基因。本发明首次利用转基因技术调控油菜木质素总量的合成，增加木质素的含量。4-CL负责催化各种肉桂酸及其衍生物生成相应的辅酶A酯，参与各种下游次生产物的合成，提高木质素总量。本发明实验结果表明转基因油菜木质素含量与受体对照(非转基因植株)相比，木质素含量均有所增高，增幅最大株系为13.41%(见表l)，转基因植株比受体对照(非转基因植株)病斑扩展面积均有所变小，变小幅度最高为30%左右(见图5)，茎杆强度则比对照(非转基因植株)普遍增强20%左右(见图6)，大大地提高了油菜的抗菌核病和抗倒伏的能力。此方法也为作物抗病、抗倒伏研究及育种开辟了一条新的思路。图1RT-PCR扩增的4一CLcDNA目标片段示意图图2植物表达载体示意图Kan为卡那抗性，C4H为启动子，4-CL基因为克隆基因插在C4H启动子之后。图3A为转基因植株生根苗；B为转基因植株移入土钵中。图4C4H启动子的转4-CL基因油菜的PCR结果5-27样为转基因植株，-为对照野生植株，+为阳性对照。结果显示转基因植株成功导入了4-CL基因。图5转基因植株与对照植株接种菌核后的比较。图6转基因植株与对照植株茎杆强度的比较。具体实施例方式通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)，或Dr即er，J"等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。实施例1(基因的克隆及测序)在NCBI数据库中检索已发表的杨树4-CL基因序列，用01igo6.0软件(通过商业途径市场购买获得，下同)设计基因编码序列的两侧引物(正向引物[5，-ATGMTCCACAAGMGMTTCATC-3'];反向引物[5，-TTATATGCCTGCCMCTTTTCTTTCAG-3，])，用来从毛白杨中扩增4一CL的对应序列。1、提取毛白杨mRNA。RNA的提取(TRIZOLTMKit提取RNA)液氮研磨lOOmg材料。A.加lmlTRIZOL，室温(20-25。C，下同)放置5min。B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。C.12000g，15min，4摄氏度。取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀后室温放置15min。D.12000g，15min,4摄氏度。去上清，加入lml7(m乙醇。E.7500g，7min,4摄氏度。去上清，空气干燥。F.DEPC—H20溶解。2、cDNA第一链的反转录采用RevertAidHMinusFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行。.-3、以cDNA为模板进行PCR扩增，得到了基因序列如SEQIDN0:1所示。实施例2(载体构建)利用PCR反应在C4H启动子5'端和3'端分别引入HindIII和BamHI酶切位点序列，然后用HindlII/BamHI分别双酶切C4H启动子PCR产物和PBI121质粒，将PCR酶切片段和质粒酶切大片段连接后，转化到感受态细胞DH5a(从商业途径获得)中扩增，然后再将4-CL片段引入到该载体(PBI121)中并取代载体(PBI121)中原有的GUS序列，而载体中的35S启动子序列则被C4H启动子序列所取代(如图2示)，其插入片段经DNA测序鉴定。实施例3(植株的转化与筛选)油菜的农杆菌LBA4404转化A.无菌苗的准备种子经70%乙醇1min,氯化汞(HgCl2)浸泡13-15min，ddH20洗5次后，平铺于MS培养基(PH5.8)中，琼脂浓度0.8%。油菜无菌苗备用。B.油菜子叶柄转化接种根癌农杆菌LBA4404(含4-CL基因)于固体培养基LB上，两天后挑取单菌落于50mlYEP液体培养基(胰蛋白胨10g+酵母提取物10g+NaC15g+MgS040.5g)中培养。取4-5天无菌苗子叶柄，于菌液中浸泡5-8min，其间轻摇，而后倒去菌液，以无菌滤纸吸去外植体上残留菌液。置于共培养基(MS+0.2mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)+lmg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-D)+200um乙酰丁香酮(AS)，PH5.8),上培养2-3天。C.将共培养后的外植体转入只含青霉素(Car)不含Kan的分化培养基中，黑暗条件的温室中进行脱菌与分化培养5-7天。再继代在添加Kan筛选压的选择培养基(MS+3mg/L6-BA+0.1mg/La-萘乙酸(NAA)+5mg/L硝酸银(AgN03)+400mg/LCar+15mg/LKan;pH5.8)中，进行筛选，待分化出再生绿芽。D.待再生芽长至lcm时切取小芽移至生根培养基(MS+0.2mg/LNAA+10mg/LKan+400mg/LCar;pH5.8)上，用加Car与Kan的固体MS培养基筛选(见图3A)。E.苗生根后，移栽入室外。IO天后移栽下土钵(见图3B)。实施例4(转化植株的核酸分析-PCR鉴定)(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取A.70%乙醇擦洗叶片，称取大约lOOmgB.加入600ul抽提缓冲液(0.2MTris—Cl，0.25NaCl，25mMEDTA，0.5%SDS，pH7.5)，室温快速研磨。C.1.5mlEpendorff管中涡旋混匀5-10s。D.12000rpm,25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，一20摄氏度沉淀过夜。E.12000rpm，15min，室温。加入70%乙醇200ul泡洗DNA沉淀。F.12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。G.加无菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。H.以总DNA为模板，进行PCR。(2)PCR程序PCR反应混合液的配比同质粒(含4-CL基因)PCR鉴定，依据植物表达载体中目的基因及其上游C4H启动子序列，设计并合成PCR引物。(正向引物[5，-CAGCTTCTTCTGCTTTCMTTACTCTC-3，]和反向弓l物[5，-CMCAGGMCTTCTCCCGCATT-3']，反应的时间和温度作如下.-94。C3min94。C45s，59°C45s72'C2min30s，30cycles72。C5min检测结果显示，阳性对照和大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带(pBI-CW:d:1527bp)，而阴性对照则没有，表明转基因油菜基因组中己经含有外源基因DNA片段，结果如图4示。实施例5(对TO代转基因株系进行木质素含量，菌核病抗性和茎杆强度的测定。(1)木质素含量的测定将切取的茎段部分在烘箱中烘干至恒重，用粉碎机充分粉碎后，称取0.3g样品，加入7.5ml72%的硫酸，3(TC消化lh，然后用蒸馏水将消化液稀释至硫酸浓度为4%，12rC下处理lh，冷却至室温后，单层滤纸过滤，最后将残渣烘干后称重，计算木质素的含量。本实验在所获得的31个(PCR阳性)37301TO代转基因株系中，选取部分转基因株系进行木质素含量的测定(见表1)。从'表中可以看出，转基因株系6、13、18的木质素含量与对照相比均有所增高，其中6号和13号株系增幅最大，分别为13.41%和11.48%。_表l转基因油菜木质素含量分析_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)菌核病抗性鉴定油菜苗期采用离体叶接种菌核鉴定。在油菜抽苔前，从同一部位剪取叶片，将叶片放入白磁盘，每盘两组，每组8片叶，叶柄用湿纱布保湿。菌丝片倒置于叶片的主脉上部叶肉。接种后用透明塑料薄膜覆盖保湿100%，23'C温育2d后,调查病斑直径(cm)。三次重复，每次重复5-7片叶，计算其平均病斑面积，结果显示，与对照非转基因植株相比，转基因株系6，13，18的病斑扩展面积变小(P〈a=0.05),分别为对照的66.42%、77.87%、72.08%(见图5)。(3)茎杆强度测定在油菜成熟期间，用倒伏试验器DIK-7401(购置日本)对油菜的茎秆强度进行测定。选取生长正常的油菜，每个小区测定15株，于茎杆中部处截去上层冠层部分，用秆强仪将植株弯成一定的角度(45°)，测定茎杆强度(N/茎)，计算其平均值。结果表明，而茎杆强度则比对照有所增强(P〈a=0.05)，增加幅度分别为27.58%、17.16%、22.84%(见图6)。SEQUENCELISTING<110>中国农业科学院油料作物研究所〈120〉毛白杨木质素单体合成基因4-CL及应用<130>毛白杨木质素单体合成基因4-CL及应用〈歸1<170〉Patentlnversion3.1<210〉1<211>1631〈212〉腿<213>毛白杨<參1cgccggatccatgaatccacaagaagaattcatctttcgccagacatcta60catcccg犯aaaccttcccctgcattcatacgttcttg犯aacttgtctaaccattcatc120aaaBccttgcctgata犯tggggcg肌tggagatgtctacacctatgctgacgttgagct180CELCELgC犯ga兆agttgcttctggtcttaac犯gattggtattc犯caaggtgacgtgat240catgctcttcctaccaeLgttcacctg犯ttcgtgcttgctttcctaggcgcttcacacag300aggtgCC8Lttatcactgctgccaatcctttctccacccctgc卿gctagcaaaacatgc360caaggcctcgELgagc犯agcttctgataacELC鄉Cttgttactacgagaaggtta犯ga420ttttgcccgag犯3gtgstgttaaggtcatgtgcgtggactctgccccggatgggtgctt480gcacttttcagagct犯cacaggc卿cgacctcaggtcgacattegtcc540cgatgatgtcgtagcattgccttattcatcagggactacagggttgccaa600gtt犯cgcaca犯gggct犯taaccagtgttgctcaacaiggt卿tggagacaatcctaa660cctgtattttMcagtgaagatgtgattctgtgtgtgctgcctatgttccatatctatgc720tctg犯ttC8gtt犯tgctctgcgggctgagagtcggtgcctcgattttgataatgcc幼a780gtttgagattggttctttactgggattgattg卿agtac犯ggtatctstagcaccggt840tgttccacctgtgEltg8tgtcaattgctaagtcacctgatcttgacaagcatgacttgtc900ttctttgaggatgat犯aatctgg鄉ggctccattgggcaagg犯cttg犯gatactgt960cagagct肌gtttcctcaggctagacttggtcagggatatgg犯tgaccgaggcaggacc1020tgttctagca3tgtgCttggcatttgccaaggaaccattcgarataaaacc鄉tgcatg麵tgggactgtagtc鄉aBtgcagageitgaagattgttgaccc3gaaac3ggggcctctct1140accgaggaacCELgCCtggtgagatctgcatccggggtgatcagatcatgaaaggatatct1200taatgaccctgaggc犯cctagacaaagaaggatggctgcac3caggcgs1260tatcggctacatgatgagcttttcatcgttgElCELgELttgaagg犯ttgat1320c犯gtata犯gggUtc兆gttgctcctgctgaactcgaagctctgttaatagcccatcc13808gagatatccgatgctgctgtagtaggattgaa卿tgag犯tgcgggagaagttcctgt1440tgcatttgtagtg犯atcaga^aagtctcaggccaccg犯agcagtatat1500ttcaa犯caggtg3tettctttcttcattgaagctattcc1560caaggcaccatctggcaagatcctgagg犯gaatctga犯gaaaagttggcgggcatata1620agagctcctcg163权利要求1.一种DNA分子，其碱基序列如SEQIDNO1所示。2、权利要求1所述的一种毛白杨木质素单体合成基因4一CL在油菜抗菌核病的中的应用。3、权利要求1所述的一种毛白杨木质素单体合成基因4一CL在油菜抗倒伏中的应用全文摘要本发明公开了一种毛白杨木质素单体合成基因4-CL及应用。该基因负责催化各种肉桂酸及其衍生物生成相应的辅酶A酯，参与各种下游次生产物的合成，是调控木质素合成的关键基因。研究结果表明，木质素含量的增加增强了植物抵抗病原物的侵染，提高了油菜茎秆强度，使其抗倒伏性明显增强。具体结果表现为转基因油菜木质素含量比受体对照木质素含量增加10％以上；转基因植株叶片比受体对照病斑扩展面积变小30％左右；转基因植株茎秆强度比对照增强达20％左右。文档编号A01H1/00GK101280315SQ200810047778公开日2008年10月8日申请日期2008年5月20日优先权日2008年5月20日发明者静刘,刘贵华,玮华,庆杨,杨向东,王新发,王汉中,郑元本申请人:中国农业科学院油料作物研究所