黄瓜CsMADS1基因过表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个黄瓜E族基因CsMADS1过表达载体及其在花器官改造中的应用，属于生物【技术领域】。该载体为含有35S启动子和黄瓜E族基因CsMADS1植物表达载体。在拟南芥中过量表达CsMADS1，获得的CsMADS1转基因植株不能正常抽苔开花，顶端分生组织处异位生长出许多簇生的针状叶片或退化的小花分枝。利用本发明的载体可以调控作物的开花时间，培育特定的转基因植株，具有一定的农业价值和观赏价值。
【专利说明】黄瓜CsMADSI基因过表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种黄瓜E类基因CsMADSI过表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002]开花是高等植物由营养生长向生殖生长转变的一个非常重要的发育过程，在合适的时间开花对大多数植物的生存和成功繁衍极为重要。开花时间的调控是一个非常复杂的过程，受自身遗传因子和外界环境因素两方面的共同影响。迄今，已经探明包括光周期、春化、温度、赤霉素、自主以及年龄等6条遗传途径参与调控开花时间。
[0003]MADS-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子，在生长发育调控和信号转导过程中发挥着重要作用,在动物、植物、真菌中都存在。在植物中，MADS-box基因的分布几乎遍布整个植物界，除在双子叶植物拟南芥、金鱼草、葡萄、矮牵牛和杨树等植物中广泛存在外，在单子叶的水稻、玉米、小麦、高粱等中也大量分布。MADS-box基因一般以基因家族的形式存在，在植物生长发育不同阶段如苗期、花期、在植物的不同部位，如营养器官根、茎、叶和生殖器官花、果实、种子中MADS-box基因都有不同程度的表达，并在其中起重要的调控作用。
[0004]MADS-box基因作为一类非常重要的转录调控因子，在开花植物中，这些蛋白在广阔的范围内具有重要的生物学意义。目前的研究表明，MADS-box除在花的发育上的重要作用外，其在调控开花早晚方面也具有一定的作用，目前这方面的实验依据主要是对模式植物拟南芥和金鱼草的研究。目前分离出的促进开花的MADS-box基因包括AGL20、AGL24、C0和SOCl，抑制开花的FLC、FLM、FR1、SVP等。
[0005]Borner等通过转座子标签的实验发现,agl20的突变体会推迟开花,也发现AGL20受GA调控，而且与诱导开花的不同途径之间相互联系着，并发现在不依赖光周期长短的条件下AGL20是开花的必需条件。kim等也从十字花科植物中分离出AGL20基因，当其过量表达会使得植物开花提早很长一段时间，而该反义基因转化植物后出现开花严重推迟的现象。Yu等发现AGL24可以调控两个与开花时间相关的基因SOCl和FT及花序分裂基因LFY，通过RNAi技术，使得AGL24的量减少或者消失，出现了开花推迟的现象，而AGL24的过量表达又会使得开花提前。Onouchi等研究了 CO对植物开花时间的影响，把CO与35S启动子相连后转到拟南芥中，发现无论在长日照还是在短日照下，转基因植物的开花都会提前。Moon等发现在短日照下，gal-3突变体植物不开花，但如果采取一定的措施使得SOCl的表达水平上升，植物会开花。FLC是第一个被鉴定出来的开花抑制子，在拟南芥中会抑制开花，且其抑制的程度与其剂量成正比。FLM的氨基酸序列与FLC的序列的同源性很高，也是一类开花抑制子。Scortecci等在拟南芥中通过使用反向遗传学的方法鉴定出了由于两个FLM的T-DNA插入突变体,含有这两类插入位点的植株都会表现早花。Clarke等在拟南芥中通过用QTL的方法发现FRI是开花推迟的主要抑制基因。Michaels等发现在野生型的晚花植物中，FRI会提高FLC的水平，而自主开花途径和春化作用会使FLC的水平下降。Hartmann等通过转座子标签的方法克隆到SVP基因，分析它的转录活性后发现其有不同的转录物，仅局限于营养器官和花原基中，没有在成熟的花中发现。SVP突变体植株会出现早花是由于营养生长期被缩短而造成的，而且纯合的突变体比杂和的突变体植株开花更早，这说明SVP不但与开花的早晚相关，而且与其存在着剂量关系，认为SVP的功能就是使植物的营养生长时期变长，而使得植物的生殖生长时期推迟。
[0006]黄瓜属葫芦科植物，广泛分布于中国各地，为主要的温室产品之一。我国瓜类作物的栽培面积在4，000万亩以上，仅黄瓜的产量就占世界的一半。对黄瓜开花相关基因的研究具有一定的理论和实践意义。最近黄瓜全基因组测序的完成标志着黄瓜功能基因组的研究进入了一个全新的阶段。尽管目前与黄瓜重要经济性状相关的基因正在逐渐被克隆，但与黄瓜开花相关基因的研究还鲜有报道。
[0007]进化树的分析发现，CsMADSI与E功能基因具有较高的同源性，可能归属于E功能基因，但其功能并不清楚，值得进一步的研究。我们克隆出CsMADSI基因并将其连到含35S启动子的表达载体PCAMBIA1301上，转化拟南芥后发现，获得的CsMADSI转基因植株不能正常抽苔开花，顶端分生组织处异位生长出许多簇生的针状叶片或退化的小花分枝。利用本发明的载体可以调控作物的开花时间，培育特定的转基因植株，具有一定的农业价值和观赏价值。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种黄瓜CsMADSI基因花特异表达载体及及其在花器官改造中的应用，该载体含有黄瓜E族基因CsMADSI，基因的上游连有35S启动子。
[0009]本发明的上述植物表达载体为pCAMBIAl301-CsMADSI，由下述方法构建而成:
(O根据 CuGI (http://cucumber, genomics, org.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黄瓜 CsMADSl 序列(Csa004117)，设计两端引物:CsMADSl_F:5’-aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG-3’(含 NcoI(含
BglII 位点)。
[0010]以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsMADSl全长。
[0011](2)回收CsMADSl的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA,通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsMADSl。
[0012](3)使用 NcoI 和 BglII 酶切 pMD18_CsMADSl，回收 CsMADSl 片段，同时用NcoI和BglII酶切pCAMBIA1301，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体pCAMBIAl301-CsMADSI。
[0013]本发明的另一目的是公开黄瓜CsMADSl在调控开花时间中的应用，该基因导入拟南芥后，获得的CsMADSl转基因植株不能正常抽苔开花，顶端分生组织处异位生长出许多簇生的针状叶片或退化的小花分枝。利用本发明的载体可以调控作物的开花时间，培育特定的转基因植株，具有一定的农业价值和观赏价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明中CsMADSl全长扩增后的电泳示意图；
图2为本发明表达载体pCAMBIAl301-CsMADSI的NcoI和BglII双酶切电泳检测图； 图3为转基因植株的PCR鉴定图；
图4为过量表达CsMADSl的转基因拟南芥植株的表达分析图，其中WT为野生型，1-3为转基因植株；
图5为过量表达CsMADSl的转基因拟南芥表型分析。其中(A)为野生型，(B)和(C)为转基因植株。
【具体实施方式】
[0015]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0016]实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus购于Τ0Υ0Β0公司，DNase I购于天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0017]实施例1:表达载体pCAMBIAl301-CsMADSI的构建
(O 弓丨物设计:根据 CuGI (http://cucumber, genomics, org.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黄瓜CsMADSl序列(Csa004117),设计两端引物:
CsMADS1-F:5，-aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG-3’(含 NcoI 位点)
CsMADS1-R:5，-aaaaAGATCTTCAAAGCATCCAACCAGGGAG-3’(含 BglII 位点)。
[0018](2)黄瓜花蕾总RNA的提取
所用黄瓜品种为华北型黄瓜。取长度约0.7 mm的花蕾I mg，取材后立刻冻到液氨中，米用 TRIzol (Invitrogen,USA)试剂法提取总 RNA:加 1.5 ml Trizol 后，室温放置 5 min,使其充分裂解。12，OOOrpm离心5 min，弃沉淀。加200 ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4°C 12, OOOg离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置30 min。4°C 12, OOOg离心10 min，弃上清。用I ml 75%乙醇洗涤2次沉淀。4°C 8, OOOg 离心 5 min,弃上清。室温晾干 10 min。用 50 uL H2O (Rnase free)溶解 RNA。
[0019](3)黄瓜花蕾总cDNA第一链的合成
黄瓜花蕾RNA用DNase I处理后用于以Oligo (dT) 18为引物的反转录:取RNA 15 uL，加Oligo (dT)18 luL，混匀，70°C保温5min，立即冰水浴，稍离心，依次加入10XM-MLV Buffer 2uL、dNTP (1mM) I uL、RNasin (40U/uL) I uL、M-MLV (200U/uL) luL，总体积 20 uL，混匀，42°C保温 60min，95°C 1min 灭活 M-MLV 酶活性，_20°C保存。
[0020](4) CsMADSl 基因的扩增
设计特异性引物:CsMADSl-F:5’-aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG -3’(含 NcoI 位点)CsMADS1-R:5’-aaaaAGATCTTCAAAGCATCCAACCAGGGAG-3’(含 BglII 位点)，以第一链产物为模板，用长片段、高保真酶KOD-PIus进行PCR扩增，PCR反应条件为:94°C 5 min ；94°C30 s ；56°C 30 s ；68°C 3.0 min，40 个循环；68°C 5 min。PCR 产物用 1.5% 琼脂糖进行电泳检测，扩增片段大小约741bp，与预期大小一致(图1)。
[0021](5) CsMADSl片段的胶回收
对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
[0022](6) CsMADSl 片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR产物14μ 1、10X Taq DNA聚合酶缓冲液 2 μ l、10mM dNTP 2 μ I, Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C处理 45 min ;先加 0.18 mL无菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀60 min,12，OOOrpm, 4°C离心lOmin。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20 μ L无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于_20°C保存备用。
[0023](7) CsMADSl片段的T/A克隆和测序
将回收片段连接到PMD18载体上，其具体步骤为:向1.5 ml离心管中分别加入:CsMADSl 片段的 cDNA 5 μ 1、pMD18 载体 0.5 μ 1、1XT4 DNA 连接酶缓冲液 I μ 1，Τ4 DNA连接酶1μ 1，加无菌水至10μ 1，用封口膜封好；置于16°C连接4-6h。将100μ I感受态肠杆菌Ε.coli DH5a加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42°C热刺激90 s后，冰浴5min;加入800μ1 LB液体培养基，37 °C、200 rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常温3，000 rpm离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清,剩余约0.1 ml时,使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-CsMADSl，具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒 DNA (50ng/y I) 2 μ l.NcoI 0.5 u 1.BglII 0.5 u 1.10 X buffer (Κ)2μ I,使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;然后将酶切正确的重组质粒pMD18-CsMADSl进行测序验证插入基因的正确性。
[0024](8)表达载体 pCAMBIAl301-CsMADSI 的构建
使用NcoI和BglII对质粒pMD18-CsMADSl和pCAMBIA1301载体进行双酶切，分别获得5’端带有NcoI和3’端带有MII的CsMADSl片段和pCAMBIA1301载体，电泳后分别进行胶回收，16°C连接4-6h;将100μl感受态肠杆菌E.COli DH5 a加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42°C热刺激90s后，冰浴5 min ;加入800 μ I LB液体培养基，37°C >200rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常温3，000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时,使用移液枪混勻,接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，37°C、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pCAMBIA1301_CsMADSl，具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒DNA(50ng/μ 1)2 μ l、NcoI 0.5 μ l、Bgl II0.5 μ IUOXbuffer (K) 2 μ 1，使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒pCAMBIAl301-CsMADSI可酶切出预期大小(741bp)的片段(图2)。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序进行序列验证(其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示)，最后获得表达载体pCAMBIA1301-CsMADSl。
[0025]实施例2:pCAMBIA1301-CsMADSl转农杆菌 GV3101 (I)农杆菌感受态细胞制备挑取农杆菌GV3101单菌落接种于5ml YEB培养基中，28°C摇培过夜，按1:100的比例接种于50 ml YEB培养基中扩培，28°C继续培养约6_7h至0D600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min ；5, 000 rpm, 4°C离心 5min,弃上清，将菌体悬于 10 ml 0.15 M NaCl 中；5，000 rpm,4°C离心5min，弃上清，菌体用I ml 20 mM CaCl2,4°C )轻轻悬浮，每管200μ1分装，或加入终浓度为20%的无菌甘油，-70°C保存。
[0026](2)农杆菌的转化及鉴定
将10 μ I质粒DNA加入200 μ I农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，液氮冷冻3_5min，37°C水浴5min,加入I mlYEB培养基，28°C摇培3_4h。10，OOOrpm,室温离心30s,弃上清，加入200 μ I YEB培养基重悬菌体，涂于YEB培养基上，28°C培养2天；碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，酶切验证。质粒再重新转化大肠杆菌(DH5 α )，过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DNA，再用酶切鉴定。
[0027]实施例3:含pCAMBIA1301-CsMADSl的农杆菌GV3101转化拟南芥 (I)拟南芥的种植
①所用的拟南芥为野生型拟南芥，为江西农业大学作物生理生态与遗传育种重点实验室保存。当年收获的种子种植后4度春化72 h，隔年种子种植后春化24 h。然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-24°C，光照强度80-200 μ mol/M2/S,光照周期为8 h黑暗、16 h光照培养。所用的土为3份蛭石，I份珍珠岩和2份黑土混合而成。
[0028]②将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。
[0029]③将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上。用保鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。
[0030]④土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。若要做转化，待抽薹2到3cm时，剪除顶花序，用营养液再浇灌一次。
[0031]⑤种子的收集:拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干燥后将拟南芥剪下放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。
[0032](2)拟南芥的转化和转化子的筛选
①制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10 ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液0D600当在1.2到1.6之间。室温5，000 rpm离心10min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使0D600在0.8左右。
[0033]②先将植株上已长出的果荚及开放的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。
[0034]③一周后再喷洒一次，收种子，在相应的抗性1/2 MS平板上筛选转化子。
[0035]④转化子的筛选:种子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。最后用无菌水洗四次。
[0036]⑤处理后的种子用Top agar (0.1%琼脂水溶液)均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面，每块150 mm直径的平皿最多种1500棵。
[0037]⑥4°C春化2到3天，移入22°C恒温室培养。将筛选出的转化子长到合适的大小后移栽到土壤中。
[0038]实施例4:转基因植株的鉴定和分析
(I)拟南芥DNA的提取
将适量的经筛选的拟南芥叶片放入1.5 ml的离心管中，加入400 μ I的SDS抽提缓冲液，用蓝色小棒研磨成浆状，加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，猛烈摇匀，12，000rpm，离心10 min。取上清至新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(PH5.2)，剧烈混匀使DNA成团，放入_20°C沉淀2hr以上。随后12，000 rpm,离心10 min。弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次后室温晾干，加适量的TE或超纯水溶解。
[0039](2)转基因拟南芥植株的鉴定
以抽提的 DNA 为模板、使用引物 CsMADSl-Fl:GAATTCTTATGGAGCGGTGGAG GTTA 和CsMADSl-Rl:TCTAGATTCCAGTGGCTGAAAGAAGC 扩增 CsMADSl 片段，PCR 的 25 μ I 体系为:PCR缓冲液(10Χ)2.5μ l、Taq 0.5 μ l、cDNA 模板 2μ IUOmM dNTP 0.5 μ IUOyM CsMADS 1-FI引物I μ 1、10 μ M CsMADSl-Rl引物I μ 1、使用无菌水补足25 μ I。反应条件为:94°C5min,35个循环，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反应lOmin。检测结果如图3所示。抽提阳性植株花蕾的总RNA，反转录后合成cDNA第一链，以CsMADS1-FI和CsMADSl-Rl为引物进行RT-PCR分析，反应体系和程序同上。内参为CsACTIN基因，弓丨物序列为:CsACTIN_F:GACATTCAATGTGCCTGCTATG, CsACTIN-R: CATACCGATGAGAGATGGCTG, PCR 的 25 μ I 体系为:PCR缓冲液(10Χ)2.5μ I, Taq 0.5 μ l、cDNA 模板 2μ IUOmM dNTP 0.5 μ IUOyM CsACTIN-F引物1μ1、10μΜ CsACTIN-R引物I μ 1、使用无菌水补足25 μ I。反应条件为:94°C 5min，26个循环，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反应1min。检测结果见图4所
/Jn ο
[0040](3)转基因拟南芥植株表型分析
通过PCR和RT-PCR的结果，对获得的阳性植物进行观察，获得的CsMADSl转基因植株不能正常抽苔开花，顶端分生组织处异位生长出许多簇生的针状叶片或退化的小花分枝(图 5)。
【权利要求】
1.黄瓜Cs姻Λ?2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.—种黄瓜CsMADSI基因花特异表达载体，其特征在于，所述表达载体为pCAMBIA1301-CsMADSl，其含有黄瓜E族基因CsMADSI，基因的上游连有35S启动子。
3.根据权利要求2所述的黄瓜CsMADSl基因花特异表达载体，其特征在于，由下述方法构建而成: 根据CuGI上登录号为Csa004117的黄瓜CsMADSl序列设计两端引物，其中CsMADS1-F引物引入了 NcoI位点，CsMADS1-R引物引入了 BglII位点，
CsMADS1-F:5’ -aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG-3’，CsMADS1-R:5’ -aaaaAGATCTTCAAAGCATCCAACCAGGGAG-3’，以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsMADSl全长; 回收CsMADSl的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsMADSl ； 使用NcoI和BglII酶切pMD18-CsMADSl，回收CsMADSl片段，同时用NcoI和BglII酶切pCAMBIA1301，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体pCAMBIAl301-CsMADSI。
4.如权利要求3所述黄瓜CsMADSl基因花特异表达载体的应用，其特征在于，将获得的植物表达载体pCAMBIAl301-CsMADSI转入农杆菌GV3101，再转入到拟南芥中，收获植株的种子，晾干后通过潮霉素筛选获得抗性苗，再通过PCR鉴定和RT-PCR检测后获得转基因植株。
【文档编号】C12N15/66GK104450735SQ201410659838
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】胡丽芳, 刘世强, 贺浩华, 蒋伦伟, 黄长干, 肖伟 申请人:江西农业大学