一种分子克隆大肠杆菌DH5α感受态细胞的简易制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种分子克隆大肠杆菌DH5α感受态细胞的简易制备方法，该方法将菌液直接分装于预冷的1.5ml小型离心管中，规避了传统感受态制备方法对大型冷冻离心机的依赖；菌液在CaCl2溶液处理前分装，可有效降低后续操作对已处于感受态菌体细胞的影响；压缩两次CaCl2溶液加入为一次性加入，简化了操作步骤，也有减少对已处于感受态菌体影响的作用。
【专利说明】-种分子克隆大肠杆菌DH日a感受态细胞的简易制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学【技术领域】，具体为一种分子克隆大肠杆菌D册a感受态细胞 的简易制备方法。
【背景技术】
[0002] 分子克隆是动物、植物、微生物等生物学科基因研究实验中最为常见的操作，但同 时也是核也的技术之一。分子克隆实验的成败，感受态细胞质量是一个重要的决定因素， 而感受态细胞的制备、胆存因为操作人员的主观因素和开展实验平台条件差异等原因的制 约，导致转化实验失败屡见不鲜，造成了试剂的浪费和毫无意义实验工作量的增加。实验技 术的不断创新和优化，是基因实验研究的重要内容之一，要从不同角度、不同层次不断探索 和丰富分子实验操作技术，才能化繁为简，因陋就简，减少浪费，提高实验的可操作性。
[0003] 在分子克隆相关文献报道中，用于重组载体转化的大肠杆菌感受态细胞的制备方 法基本相同，通用的的方法步骤如下：
[0004] (1)将冷冻保藏的大肠杆菌在LB琼脂平板上划线，37C培养16-2化；
[0005] (2)在划线平板上挑一个单菌落，接种于盛有20ml LB培养的250ml H角瓶中， 37C摇床培养至菌体细胞的0D600值为0. 3-0. 5 ;
[0006] (3)将菌液冰浴放置lOmin，转移至2个IOml预冷的无菌离也管中，4。400化/ min 离也 IOmin ;
[0007] (4)弃上清，倒置离也管Imin,冰浴IOmin ;
[000引 妨分别向2离也管中加入5ml用冰预冷的0. Imol/L化化溶液息浮菌体，冰浴 20min ；
[0009] 巧)4°C，4000r/min离也lOmin，弃上清。再分别向2离也管各加Iml冰预冷 0? Imol/L CaCl^溶液，悬浮菌体；
[0010] (7)向离也管中加入终浓度为10%的无菌甘油，再按每份200 y 1分装于小离也管 中，-7(TC胆存备用。
[0011] 采用W上传统的大肠杆菌感受态制备方法虽然技术成熟，可W满足实验需求，但 也存在一些不足，该些不足集中体现在：制备好的大肠杆菌感受态细胞如果加入甘油，会使 转化效率明显下降，而且胆存时间越长，转化效率下降越明显；制备好的大肠杆菌感受态细 胞如果不加甘油，就难W保存，无法做到随用随拿，如果每次转化都制作新的感受态细胞， 繁杂是操作过程无疑会增加实验工作量；另外，保存感受态细胞需要价格昂贵的超低温冰 箱，不利于简陋实验室开展相关实验。
【发明内容】
[0012] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种分子克隆大肠杆菌DH5 a感 受态细胞的简易制备方法，该方法是专口针对大肠杆菌D册a开发的一种行之有效的感受 态制备技术。感受态细胞的制备原理基本相同，操作步骤和处理方法是感受态制备技术的 核也。本发明技术方案较好的解决了相对繁琐的感受态制备方法，提高了相关工作的便捷 性、高效性。
[0013] 该方法解决H个方面的问题；（1)简化分子克隆实验中所用大肠杆菌感受态细胞 的制备方法，优化感受态细胞制备和重组载体转化实验环节的衔接；(2)回避感受态细胞 低温保存对低温设备的苛刻要求，便于因陋就简开展相关实验；（3)感受态细胞的制备和 重组载体转化实验同步进行，有利于感受态细胞高转化效率的发挥，对提高大片段重组载 体的转化效果十分有利。
[0014] 其技术方案为：
[0015] 一种分子克隆大肠杆菌D册a感受态细胞的简易制备方法，包括W下步骤：
[0016] (1)从铺有大肠杆菌D册a的平板中挑选一个单菌落，接种到2ml LB液体培养基 中，37°C，220r/min培养过夜；
[0017] (2)吸取200 y 1菌液转接到装有20ml LB液体培养基H角瓶中，37C摇床培养至 菌体细胞的0D600值为0. 3-0. 5 ;
[0018] (3)将菌液分装于15个1. 5ml预冷的无菌离也管中，每管装1. 5ml菌液，冰浴 20min ;4°C，4000;r/min 离也 IOmin,弃上清；
[0019] (4)每管加入200y 1 0. Imol/L CaCls溶液，轻柔吹吸，息浮细胞，冰浴20min ;直 接用于转化实验或0-4 C胆存，5天内可用。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0021] 本发明技术通过不断的实践探索，摸索出了一种简洁有效的大肠杆菌感受态制备 和胆存方法，在实践中可操作性强，具有广泛的推广和借鉴意义。
[0022] 在本发明技术方案中，对操作方法的探索集中体现在，将培养好的菌液直接分装 于小型离也管中，该样用小型冷冻离也机即可完成冷冻离也操作，摆脱了传统感受态细胞 制备操作对昂贵的大型冷冻离也机的依赖，是感受态细胞的制备变得更加容易、便捷，有利 于仪器条件相对简陋的实验室开展工作；提前分装菌液（CaCls溶液处理前），大大降低了 后续操作对处于感受态细胞菌体的影响，主要包括传统方法中操作时的体温、环境温度、甘 油的加入和分装感受态等环节。
[0023] 扬弃了传统制备方法中化C12溶液使用方法，改两次加入为一次性加入，该样就简 化了操作步骤，使感受态的制备过程更加便捷，减少了污染几率，也节约了时间。
[0024] 本发明技术方案中，除了操作步骤和处理方法上有所改进，在制备量上也可W更 加灵活，可根据实际对感受态的使用量，灵活调整摇床培养的菌液量，分装小型离也管的数 量也可随意调整，该些也是本发明技术方案的优势之一。
[0025] 本发明技术方案重在突出大肠杆菌感受态制备的简洁性、高效性和可操作性，使 感受态的制备与转化重组载体的连贯实验衔接的更加灵活。
[0026] 综上所述，严格按照本发明技术方案，取得了良好的大肠杆菌D册a感受态制备 效果，获得了简洁高效的操作步骤和处理方法，提高了相关工作的效率。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步说明。
[0028] 本发明是将菌液直接分装于预冷的小型离也管（1. 5ml)中，规避了传统感受态制 备方法对大型冷冻离也机的依赖；菌液在化Cl2溶液处理前分装，可有效降低后续操作对已 处于感受态菌体的影响；压缩两次化C12溶液加入为一次性加入，简化了操作步骤，也有减 少对已处于感受态菌体影响的作用。
[0029] 具体步骤为：
[0030] (1)从铺有大肠杆菌D册a的平板中挑选一个单菌落，接种到2ml LB液体培养基 中，37°C，220r/min培养过夜；
[003。 似吸取200 ill菌液转接到装有20ml LB液体培养基立角瓶中，37C摇床培养至 菌体细胞的ODew值为0. 3-0. 5 ;
[0032] (3)将菌液分装于15个1. 5ml预冷的无菌离也管中，每管装Iml菌液，冰浴20min ; 4°C，4000;r/min 离也 lOmin,弃上清；
[0033] (4)每管加入200 U 1 0. 5mol/L CaC12溶液，轻柔吹吸，息浮细胞，冰浴20min。可 直接用于转化实验；或0-4C胆存，一周内可用；或加甘油长期保存。
[0034] 采用本发明技术，示范和验证方案的可行性和有效性，具体操作如下：
[00巧]大肠杆菌D册a感受态细胞制备：
[0036] (1)从铺有大肠杆菌D册a的平板中挑选一个单菌落，接种到2ml LB液体培养基 中，37°C，220r/min培养过夜；
[0037] 似吸取200 ill菌液转接到装有20ml LB液体培养基立角瓶中，37C摇床培养至 菌体细胞的ODew值为0. 3-0. 5 ;
[0038] (3)将菌液分装于15个1. 5ml预冷的无菌离也管中，每管装Iml菌液，冰浴20min ; 4°C，4000;r/min 离也 lOmin,弃上清；
[0039] (4)每管加入200 U 1 0. 5mol/L CaC12溶液，轻柔吹吸，息浮细胞，冰浴20min。可 直接用于转化实验；或0-4C胆存，5天内可用；或加甘油长期保存。
[0040] 感受态转化实验效果：
[0041] 申请人:W IOOy 1本发明技术制备的大肠杆菌D册a感受态细胞转化0. Ing/y 1 pUC19control plasmid为阳性对照，W不加质粒的为阴性对照进行转化实验。转化方法和 步骤采用常规的热激法。
[0042] 转化率的计算：
[0043] 转化子总数=(菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积）/涂板菌液体积
[0044] 转化效率=转化子总数/质粒DNA加入量
[0045] 结果显示，感受态细胞制备后的第一天和第H天用于转化实验，转化效率均达到 了 1 X ICT7 W上；制备后第五天用于转化实验，H次重复中有一次达到了 1 X ICT7 W上，两次 达到> lXlCre W上，说明0-4C胆存5山仍然具有较高转化效率（表1)。
[004引按照转化效率1X IO6C化/ y g DNA可满足普通的亚克隆实验，1X IO7C化/ y g DNA 用于作更复杂的亚克隆、有限量的DNA的转化、T-克隆实验的常用标准，本发明技术方案制 备的感受态细胞基本可W满足大部分分子克隆实验，说明本发明技术具有良好可行性。
[0047] 表1感受态细胞转化效果检测
[0048]
【权利要求】
1. 一种分子克隆大肠杆菌DH5 a感受态细胞的简易制备方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 从铺有大肠杆菌DH5 a的平板中挑选一个单菌落，接种到2ml LB液体培养基中， 37°C，220r/min 培养过夜； (2) 吸取200 ill菌液转接到装有20ml LB液体培养基三角瓶中，37°C摇床培养至菌体 细胞的0D600值为0. 3-0. 5 ; ⑶将菌液分装于15个1. 5ml预冷的无菌离心管中，每管装1. 5ml菌液，冰浴20min ; 4°C，4000r/min 离心 lOmin，弃上清； (4)每管加入200 yl 0. lmol/L CaCl2溶液，轻柔吹吸，悬浮细胞，冰浴20min ;直接用 于转化实验或0-4°C贮存，5天内可用。
【文档编号】C12N1/36GK104357372SQ201410659417
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】孙会忠, 王小东, 宋月芹, 董钧锋, 朱金峰 申请人:河南科技大学