大肠杆菌噬菌体ms2标准样品及其制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物分析测试、临床医学检验和食源性RNA病毒检测的技术领域，具 体设及一种大肠杆菌瞻菌体MS2标准样品。
【背景技术】：
[0002] 瞻菌体MS2属于非细胞原生物的细菌病毒，专性感染和寄生于相应的活细菌体 内，具有作为水体中肠道病毒指示物的基本条件；对人没有致病性，且在有肠道病毒污染的 水环境中普遍存在；可W进行高浓度接种和现场试验；数量高于肠道病毒。在形态特征、理 化特性、对自然环境条件和消毒剂的抗性等方面与肠道病毒类似；检测操作具有简便快速、 安全可靠、受环境影响小和设备简单等优点。
[0003]与其他病毒的宿主如人类、动物和植物等相比，瞻菌体MS2具有如下优势；（1)在 实验室里，瞻菌体MS2易于快速培养，对实验室的空间、设施和设备没有特别要求，并且能 够高浓度制备（可达1〇1°~10叩即/mL)。（2)与肠道病毒的传统指示生物如大肠菌群、粪 链球菌等相比，瞻菌体MS2的生物结构、组成成分、复制方式和消毒抗性等与肠道病毒更加 相似。B.Benoit等对不同类型水样的检测表明，可培养的肠道病毒和瞻菌体MS2在数量上 存在很好的对应关系。（3)瞻菌体在有肠道病毒污染的水体中普遍存在，且数量甚多，对水 体净化和消毒处理的抵抗力至少与肠道病毒相当；同时其不会在水中繁殖，不具有致病性， 可W通过简单、快速、低廉的方法检测。
[0004] 随着分子生物学技术的迅速发展，W聚合酶链反应技术（polymerasechain reaction,PCR)为基础的各种分子生物学诊断技术，因其具有特异性强、灵敏度高、线性范 围广、重复性好、定量准确、方便快捷等优点，成为生物医学领域内最有价值的研究手段，已 经广泛地应用于临床标本的检测。在核酸检测过程中，分子生物学检测方法的准确性容易 受到W下多种因素的影响；（1)仪器控温程序不正确，或不能精确控温；（2)逆转录酶和化q 酶活性低、反应液质量差，引物、探针设计不合理；（3)核酸模板提取量少，检测的目的片段 降解，残留的己醇和酪量过大，样品杂质去除不干净，如粪便标本中的胆盐，血液中的血红 素及尿中的尿素会对PCR反应产生抑制作用；(4)病毒核酸序列发生变异；（5)实验操作人 员的操作失误。因此，在做核酸特别是RNA扩增实验时，需要有严格的质量控制措施，即需 要有特定的质控物，同时，要对核酸进行定量测定，通常还须有核酸标准物。质控物和标准 物须具有W下特点；（1)容易制备；（2)在贬存和使用过程中具有足够的稳定性；（3)无生 物传染性；(4)能监测检测的全过程，结果可靠。目前RNA病毒质控物主要有裸露的RNA片 段、病毒颗粒和盎甲R(armoredRNA)。大肠杆菌瞻菌体MS2是包膜蛋白包裹结构RNA结构， 与RNA病毒结构相似，且MS2无致病性；在食源性RNA病毒检测体系中加入大肠杆菌瞻菌体 MS2作为内部质控物，是RNA病毒检测较为理想的内部质控物质。因而此类生物质可作为的 质控物来监控病毒颗粒裂解效率和核酸提取等整个检测过程，弥补了裸露RNA片段作为质 控物和标准物的不足。
【发明内容】
：
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌瞻菌体MS2标准物质，浓度为 1. 57Xl〇iip化/mL;该标准物质在食源性RNA病毒检测过程中可被用作为检测过程质控物 质。
[0006] 本发明为解决其技术问题采用W下的技术方案：
[0007] 一种大肠杆菌瞻菌体MS2标准物质的制备，包括下列步骤：
[000引（一）宿主菌的制备
[0009] 先用接种环挑出一点ATCC15597大肠杆菌菌种接种在TSA-YE平板上过夜培养； 挑取1移菌环细菌至lOmLLB液体培养基中，培养过夜；
[0010] (二）大量瞻菌体MS2制备
[0011] 1、将（一）制备的宿主菌培养液按照0. 5% (体积比）接种到LB液体培养基中， 36 +rc，150巧m振荡培养4-化后，按0.5-1 % (体积比）的比例将瞻菌体（108~10 9p化/ mL)接种到上述细菌培养液中，确保瞻菌体个数与细菌个数之比在0. 1~2. 0。
[001引 2、将接种后细菌培养液在36+rC，150巧m振荡培养化或过夜，取培养液在10 OOOg下离屯、lOmin，收集上清液；用孔径为0. 22 y m的膜过滤即得纯化的瞻菌体悬液。
[0013] 3、测定瞻菌体的效价
[0014] 采用双层琼脂法。具体操作如下：
[0015] 将待测瞻菌体悬液做10倍系列稀释至1〇1°倍，取宿主菌培养液0. 2mL分别加至 各平皿的底层营养琼脂，吸取适当稀释度的瞻菌体悬液0.ImL分别加至各平皿与宿主菌混 合，倒入2~3血冷至50°C的上层琼脂，混匀，凝固后37°C倒置培养18~2化，每一稀释梯 度做3个重复，计算瞻菌斑数。取瞻斑数在30~300个之间的平皿的平均值计算效价：
[0016] 效价（P化/血）=平均瞻斑数X稀释倍数X 10
[0017] 4、瞻菌体的稀释
[0018] 采用悬浮培养基（SM)对瞻菌体溶液进行稀释，并分装于2mL细胞冻存管中保存。
[0019] (S)稳定性测试
[0020] 不同时间点分别取25°C、4°C、-80°C保存的样品3管进行瞻菌体效价测定，并进行 统计分析各保存条件的稳定性；25°C、4°C取样时间持续6个月，每1个月取样一次；-80°C 取样时间持续24个月，每2个月取样一次。
[0021] (四）均匀性测试
[0022] 取-8(TC保存的样品15管进行瞻菌体效价测定，并进行统计分析，评估标准样品 的均匀性。
[0023](五）标准样品定值
[0024] 根据均匀性测试的结果进行不确定度评估，并进行标准样品的定值，该大肠杆菌 瞻菌体MS2标准样品浓度为1. 57Xl〇iip化/mL。
[0025] 本发明的有益效果：
[0026] 本发明制备的瞻菌体MS2可W作为食源性RNA病毒检测过程中可被用作为检测过 程质控物质，均匀性和稳定性好，效价高。
【附图说明】：
[0027] 图1为本发明实施例1大肠杆菌瞻菌体MS2效价测试图。
[0028] 图2为本发明实施例2大肠杆菌瞻菌体MS2实时巧光RT-PCR标准曲线.纵坐标 为Ct值，横坐标为大肠杆菌瞻菌体MS2浓度（P化/mL)。
【具体实施方式】：
[0029] 下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。
[0030] 实施例1 ;大肠杆菌瞻菌体MS2标准样品制备
[0031] (一）宿主菌的制备
[0032] 先用接种环挑出一点ATCC15597大肠杆菌菌种接种在TSA-YE平板上过夜培养； 挑取1移菌环细菌至lOmLLB液体培养基中，培养过夜；
[0033] (二）大量瞻菌体MS2制备
[0034] 1、将（一）制备的宿主菌培养液按照0. 5% (体积比）接种到LB液体培养基中， 36 +rc，150巧m振荡培养4-化后，按0.5-1 % (体积比）的比例将瞻菌体（108~10 9p化/ mL)接种到上述细菌培养液中，确保瞻菌体个数与细菌个数之比在0. 1~2. 0。
[0035] 2、将接种后细菌培养液在36 +rC，150巧m振荡培养化或过夜，取培养液在10 OOOg下离屯、lOmin，收集上清液；用孔径为0. 22ym的膜过滤即得纯化的瞻菌体悬液。
[0036] 3、测定瞻菌体的效价
[0037] 采用双层琼脂法。具体操作如下：
[0038] 将待测瞻菌体悬液做1