专利名称：：一种鸭感染里默氏杆菌病和大肠杆菌病的快速鉴别诊断方法
技术领域：
：本发明属分子生物学领域，具体是一种鸭感染里默氏杆菌病和大肠杆菌病的快速鉴别诊断方法。
背景技术：
：鸭疫里默氏杆菌病(Riemerellaanatipestiferinfection,RAI)是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA)引起的一种主要危害2-3周龄雏鸭的接触性传染病，该病呈急性或慢性败血症形式，其病理特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎，常常与大肠杆菌混合感染，给疾病的诊断和治疗带来一定的困难；本病发病率高、死亡率高、淘汰率高、耐过鸭生长缓慢等而给养鸭业造成巨大的经济损失。RA为革兰氏阴性杆菌。大肠杆菌病(Colibacillosis)是由大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)某些致病性血清型菌株引起的疾病，E.coli是革兰氏阴性杆菌。雏鸭发生大肠杆菌病，其发病病理特征与鸭疫里默氏杆菌病极为相似，主要是纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎，通过临床症状和病理变化来鉴别这两种疫病有一定的困难。传统检测两种疾病是通过细菌分离，然后再分别进行生化反应的鉴定，已报道的研究只是针对RA的检测建立了PCR的诊断，缺乏对两种细菌混合快速诊断方法。例如乐涛等对RA和E.coli的混合感染进行了细菌的分离鉴定；胡清海等对应用PCR技术检测鸭疫里默氏杆菌进行了相关研究。这些应用细菌分离鉴定的方法对RA和E.coli混合感染进行检测，但是存在耗时且敏感性不强，而单一针对RA的PCR检测，对RA和E.coli的混合感染则未能同时完成检测。
发明内容为克服现有技术的不足，本发明提供一种鸭感染里默氏杆菌和大肠杆菌的快速鉴别检测方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是本方法应用分子生物学技术，选择鸭感染里默氏杆菌42-KD外膜蛋白基因和大肠杆菌phoA基因合成了两对特异性引物，在一个反应系统同时对两种病菌的基因分别进行扩增，其扩增产物的大小分别为809bp和622bp，两者大小相差187bp，足以将两者明显区分。因此，建立的RA和大肠杆菌两重PCR方法，一方面可分别对这两种细菌引起的鸭病进行诊断，另一方面还可以对这两种相似的细菌进行鉴别。具有快速、特异、敏感的优势。检测方法步骤如下1)增菌培养基的制备增菌培养基按下列方法进行配制将Nac1，胰蛋白胨，牛肉汤混匀，在HI值7.27.4、温度121°C或107.9kPa高压条件下，灭菌15min;培养基冷却至室温，无菌加入小牛血清，使之最终浓度为10%，混匀后可使用或密封放置室温保存备用。2)待检样品的准备A.细菌平板分离物用巧克力平板对疑似病鸭进行细菌分离，在烛缸中培养2448小时后取平板上生长菌落，用无菌生理盐进行10—9的稀释。B.细菌增菌培养物将病死鸭的脑组织，研磨后用灭菌生理盐水l:5的重量比例稀释，稀释病料中加入增菌培养基500iiL，稀释病料在培养基里的浓度为20%，在37t:摇床培养4h8h，将培养物10000r/min离心，去除上清400yL，剩余的病料培养物吹打均匀，留着抽提DNA用。3)待检样品DNA抽提取待检病鸭的细菌平板分离物或者细菌增菌培养物的样品约50ul，置于1.5mL离心管中，置于99。C水浴1015min，获得的模板DNA，用于PCR扩增或置-2(TC保存。4)PCR检测A.DNA抽提将细菌平板分离物和细菌增菌培养物99t:水浴1015min处理后，-2(TC保存备用。B.反应液配置在冰浴条件下，按下列试剂用量在PCR反应管中分别加入下列各成分-10XBuffer:2.5iiL，终浓度为1倍；-25mmolMgCl2:1.5iiL，终浓度为1.5mmo1;-5U/iiLTaqDNA聚合酶0.3iiL，终浓度为0.06U/iiL;-25mmol/LRA特异性引物1PL，终浓度为0.5mmol/L;-25mmol/LE.coli特异性引物1PL，终浓度为0.5mmol/L。-dNTPs:浓度为2.5mM的0.5iiL;-DNA模板3iiL。-RNaseFree:补足至总体积为25iiL。C.反应程序取步骤B配置好的反应液，瞬时离心混匀，将PCR反应管置于PCR仪内，按如下程序进行反应①95°C，5min;②94°C，lmin;③55°C，50s;72°C，lmin;②④循环30次；72°C，8min;⑥4。C结束反应；将PCR产物直接用于电泳或者保存于4。C冰箱以备电泳；RA和E.coli的DNA最低检测浓度均为2.98pg。5)PCR检测结果判断将10iiLPCR产物与2iU凝胶电泳加样缓冲液混合均匀，加至琼脂糖凝胶样品孔中，同时设置标准分子量DNAMarker对照，以5V/cm胶长的稳压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端2cm3cm时停止。将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外线透射仪上观察，与标准DNA分子量及阳性对照比较分析，判定结果，并用凝胶成像系统拍照保存。若应用二重PCR，被检样品在809bp的片段位置上出现一条DNA扩增带，判定为RA阳性，记为RA"+";被检样品在622bp的片段位置上出现一条DNA扩增带，判定为E.coli阳性，记为E.coli"+";若被检样品在该两处位置无DNA扩增带出现，则判定为RA、E.coli阴性，记为RA(-)、E.coli(-)。本发明的优点是本发明方法与传统的鉴别诊断方法相比较，需要的费用更低、效率更高、特异性更强。图1是引物特异性试验琼脂糖凝胶电泳图。图中1.标准DNA分子量(lOObpladderDNAMarker);2-6.依次是对样品大肠杆菌(_)、沙门氏菌(_)、巴氏杆菌(_)、葡萄球菌(_)和鸭疫里默氏杆菌(+)的RA扩增结果；7-11.依次是对样品沙门氏菌(-)、巴氏杆菌(-)、葡萄球菌(-)、鸭疫里默氏杆菌(_)和大肠杆菌(+)的E.coli扩增结果；注"809bp"为扩增RA获得的目的基因片段；"622bp"为扩增E.coli获得的目的基因片段；"-"表示检测结果阴性；"+"表示检测结果阳性。图2是扩增反应敏感性试验琼脂糖凝胶电泳图。图中1.标准DNA分子量(100bpladderDNAmarker);2.参考株RA(+)和E.coli(+)DNA浓度为190ng/L的扩增电泳结果；3.参考株RA(+)和E.coli(+)DNA浓度为47.50ng/L的扩增电泳结果；4.参考株RA(+)和E.coli(+)DNA浓度为11.88ng/L的扩增电泳结果;5.参考株RA(+)和E.coli(+)DNA浓度为2.98ng/L的扩增电泳结果；6.参考株RA(+)和E.coli(+)DNA浓度为0.75ng/L的扩增电泳结果；7.参考株RA(+)和E.coli(+)DNA浓度为0.19ng/L的扩增电泳结果;8.阴性对照(_)的扩增电泳结果。注"809bp"为扩增RA获得的目的基因片段；"622bp"为扩增E.coli获得的目的基因片段；"-"表示检测结果阴性；"+"表示检测结果阳性。具体实施例方式1.增菌培养基的制备增菌培养基按下列方法进行配制-Nacl:0.5g;——蛋白胨lg;-牛肉汤90mL(浓度为0.5g/ml);——小牛血清10mL(5X浓度)将Nacl，胰蛋白胨，牛肉汤混匀，在规范的HI值7.27.4，温度121°C或6107.9kPa高压条件下，灭菌15min，培养基冷却至室温，无菌加入小牛血清，混匀后可使用或密封放置室温保存备用。注新制备的培养基均应做无菌检查，并用已知阳性菌和阴性菌进行测试，以保证培养基的质量。2.待检样品的准备细菌平板分离物用巧克力平板对疑似病鸭进行细菌分离，在烛缸中培养2448小时后取平板上生长菌落进行10—9的稀释。细菌增菌培养物将病死鸭的脑组织，研磨后用灭菌生理盐水1:5的比例稀释，稀释病料中加入胰蛋白胨肉汤+小牛血清(10%)的培养基500iiL(稀释病料在培养基里的接种量20%)，37。C摇床培养4h8h，将培养物10000r/min离心，去除上清400iiL，剩余的病料培养物吹打均匀，留着备用抽提DNA。3.待检样品DNA抽提无菌采取待检病鸭增菌培养后的组织液或者分离培养的细菌稀释液样品约50ul，置于1.5mL离心管中99°C水浴1015min，获得的模板DNA可直接用于PCR扩增或置-20°C保存备用。4.PCR检测DNA抽提将细菌平板分离物和细菌增菌培养物99°C水浴1015min处理后，-2(TC保存备用；反应液配置在冰浴条件下，按下列试剂用量在PCR反应管中分别加入各成分-10XBuffer:2.5iiL，终浓度为1倍；-25mmolMgCl2:1.5iiL，终浓度为1.5mmo1;-5U/iiLTaqDNA聚合酶0.3iiL，终浓度为0.06U/iiL;-25mmol/LRA特异性引物1PL，终浓度为0.5mmol/L;-25mmol/LE.coli特异性引物1PL，终浓度为0.5mmol/L-dNTPs:浓度为2.5mM的0.5iiL;-DNA模板3iiL-RNaseFree:补足至总体积为25iiL。反应程序加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于PCR仪内，按如下程序进行反应①95。C，5min;②94°C，lmin;③55。C，50s;④72°C，lmin;②④循环30次；⑤72。C，8min;⑥4t:结束反应。PCR产物直接用于电泳或者保存于4t:冰箱以备电泳。RA和E.coli的DNA最低检测浓度均为2.98pg，500nmol/L。表1两重PCR的引物序列及扩增片断长度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4.PCR检测结果判断将10PLPCR产物与2iU凝胶电泳加样缓冲液混合均匀，加至琼脂糖凝胶样品孔中。同时设置标准分子量DNAMarker对照。以5V/cm胶长的稳压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端2cm3cm时停止。将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外线透射仪上观察，与标准DNA分子量及阳性对照比较分析，判定结果，并用凝胶成像系统拍照保存。若应用二重PCR，被检样品在809bp的片段位置上出现一条DNA扩增带，判定为RA阳性，记为RA"+";被检样品在622bp的片段位置上出现一条DNA扩增带，判定为E.coli阳性，记为E.coli"+";若被检样品在该两处位置无DNA扩增带出现，则判定为RA、E.coli阴性，记为RA(-)、E.coli(-)。权利要求一种鸭感染里默氏杆菌病和大肠杆菌病的快速鉴别诊断方法，其特征在于，选择鸭感染里默氏杆菌42-KD外膜蛋白基因和大肠杆菌phoA基因合成了两对特异性引物用于两种病菌的基因扩增，其扩增片段大小分别为809bp和622bp，两者大小相差187bp，建立的RA和E.coli两重PCR方法能快速、特异、敏感地检测并同时鉴别这两种细菌。检测方法步骤如下1)增菌培养基的制备增菌培养基按下列方法进行配制将NaCl、胰蛋白胨和牛肉汤混匀，在PH值7.2～7.4、温度121℃或107.9kPa高压条件下，灭菌15min；培养基冷却至室温，无菌加入小牛血清使之最终浓度为10％，混匀后可使用或密封放置室温保存备用；2)待检样品的准备A.细菌平板分离物用巧克力平板对疑似病鸭进行细菌分离，在烛缸中培养24～48小时后取平板上生长的菌落，用无菌生理盐水作10-9的稀释；B.细菌增菌培养物将病死鸭的脑组织，研磨后用灭菌生理盐水1∶5的重量比例稀释，稀释病料中加入增菌培养基500μL，稀释病料在培养基里的比例为20％，37℃摇振培养4h～8h，将培养物10000r/min离心，去除上清400μL，剩余的培养物吹打均匀，留作抽提DNA用；3)待检样品DNA抽提取待检病鸭的细菌平板分离物或者细菌增菌培养物的样品约50μl，于1.5mL离心管中，置99℃水浴10～15min，获得模板DNA，用于PCR扩增或置-20℃保存；4)PCR检测A.DNA抽提将细菌平板分离物和细菌增菌培养物99℃水浴10～15min处理后，-20℃保存备用；B.反应液配置在冰浴条件下，按下列试剂用量在PCR反应管中分别加入下列各成分——10×Buffer2.5μL(终浓度为1倍)；——25mmolMgCl21.5μL(终浓度为1.5mmol)；——5U/μLTaqDNA聚合酶0.3μL(终浓度为0.06U/μL)；——25mmol/LRA上下游半巢式引物1μL(终浓度为0.5mmol/L)；——25mmol/LE.coli上下游半巢式引物1μL(终浓度为0.5mmol/L)；——dNTPs浓度为2.5mM的0.5μL；——DNA模板3μL——RNaseFree双蒸水补足至总体积为25μL；C.反应程序取步骤A配置好的反应液，瞬时离心混匀，将PCR反应管置于PCR仪内，按如下程序进行反应①95℃，5min；②94℃，1min；③55℃，50s；④72℃，1min；②～④循环30次；⑤72℃，8min；⑥4℃结束反应；将PCR产物直接用于电泳或者保存于4℃冰箱以备电泳。RA和E.coli的DNA最低检测浓度均为2.98pg；5)PCR检测结果的判断将10μLPCR产物与2μl凝胶电泳加样缓冲液混合均匀，加至琼脂糖凝胶样品孔中，同时设置标准分子量DNAMarker对照，以5V/cm胶长的稳压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端2cm～3cm时停止；将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外线透射仪上观察，与标准DNA分子量及阳性对照比较分析，判定结果，并用凝胶成像系统拍照保存；若应用二重PCR，被检样品在809bp的片段位置上出现一条DNA扩增带，判定为RA阳性，记为RA“+”；被检样品在622bp的片段位置上出现一条DNA扩增带，判定为E.coli阳性，记为E.coli“+”；若被检样品在该两处位置无DNA扩增带出现，则判定为RA和E.coli阴性，记为RA(-)和E.coli(-)。全文摘要本发明公开了一种鸭感染里默氏杆菌病和大肠杆菌病的快速鉴别诊断方法。该方法是选择鸭感染里默氏杆菌42-KD外膜蛋白基因和大肠杆菌phoA基因合成了两对特异性引物用于两种病菌的基因扩增，其扩增片段大小分别为809bp和622bp，两者大小相差187bp，建立的RA和E.coli两重PCR方法能快速、特异、敏感地检测并同时鉴别这两种细菌。本发明的优点是本发明方法与传统的鉴别诊断方法相比较，需要的费用更低、效率更高、特异性更强。文档编号C12Q1/68GK101736088SQ201010102938公开日2010年6月16日申请日期2010年1月29日优先权日2010年1月29日发明者尤岩岩,杨宗维,韦天超,韦平申请人:广西大学