一种表达内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及从一种超嗜热古菌即掘越氏火球菌Pyrococcus horikoshii中通过PCR扩增得到内切-β -1,4-葡聚糖酶基因，构建重组表达质粒并转化至大肠杆菌中进行表达。
【背景技术】
[0002]目前，在现有的纺织应用领域(例如织物处理、洗涤、柔化、人造丝加工)中，使用传统的混合型纤维素酶制剂，会对纤维主体结构造成不必要的损伤。由于织物处理及生物抛光是一个高温处理过程，而现有酶制剂的处理温度低于处理工艺的其他步骤，在实际使用的过程中需要增加降温和升温的过程，增加了工艺的复杂程度和生产成本，如能开发出嗜热且具有单一内切纤维素酶活性的极端酶制剂，将能更适合用于纺织行业降解天然结晶纤维素过程，有助于现有工艺的优化和节能减排。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种表达内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌的构建方法。通过PCR扩增得到掘越氏火球菌中已知具有水解结晶纤维素的能力的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因，构建了一株可高产可溶性表达内切-β-1，4-葡聚糖酶的重组大肠杆菌，以实现极端耐热酶制剂国产化的目的。
[0004]本发明的技术方案:掘越氏火球菌A horikoshii (美国菌种保藏中心编号为ATCC700860)中的内切-β_1, 4-葡聚糖酶基因SEQ ID N0.1。
[0005]表达内切-β-1，4-葡聚糖酶的重组大肠杆菌的构建方法，从掘越氏火球菌Ahorikoshii (美国菌种保藏中心编号为ATCC700860)中提取基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，引物:
phEG-SG-C-F: 5 , -CAGCAGATCATATGGAAAATACAACATATCAAACACCG-3 ,phEG-SG-C-R: 5 ^ -CTCTAAGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAACTATC-3 ^
Mut-SD-F: 5 z -CGCTTGGTGGGGTGGTAATCTAATG-3 ^
Mut-SD-R: 5 z -CATTAGATTACCACCCCACCAAGCG-3 ^
PCR扩增体系:在0.5ml PCR管仲按顺序加入以下试剂:10X PCR缓冲液5 μ? ； dNTPs混合物(每种 2.5mM) Iμ? ；10 μΜ phEG-SG-C-F ?μ? ；10 μΜ phEG-SG-C-R ?μ? ;基因组 DNA ?μ? ；Vent DNA 聚合酶 0.5μ? ;无菌水 40.5 μ? ；
PCR扩增条件:95°C预变性3min ;95°C变性30 s、55°C退火30 s、72 °C延伸72 s，30个循环；最后72°C延伸5min; 12°C保温，获得内切-β _1，4-葡聚糖酶基因SEQ ID No:1 ；
以 phll71-sgc 为模板，分别采用 phEG-SG-C-F、Mut-SD-R 和 Mut-SD-F、phEG_SG_C-R 获得不包含类SD序列的phll71-sgc的两个部分，之后采用拼接PCR，获得了不包含SD序列的内切4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut_sd, SEQ ID No:2,该片段经Nde I和NotI双酶切后连入大肠杆菌表达载体pET21a中，获得重组载体pET21-phll71-Sgc-mut-Sd，转化大肠杆菌工程菌株疋coli BL21 (DE3) plys得到重组菌疋coli BL21 (DE3)plys-pET21a-phll71-sgc-mut_sd0
[0006]phll71-sgc-mut-sd的诱导表达:表达条件为37°C，200 r/min, LB培养基培养，接种时加入终浓度为100 Pg/mL的氨苄青霉素，培养至OD600 = 0.6，再加入IPTG至终浓度0.1mM诱导表达3 h。中间分别于诱导后1.5 h及3 h取样。4167 r/min离心收集菌体,超声波破碎(条件:总时间2 min，开2 S，关2 S，功率50%，冰浴)，取样80 PL作为全蛋白样品，余样再于12000 r/min，4°C条件离心lOmin，再取80 PL上清作为破菌上清，分别加入20 μ?5XSDS PAGE上样缓冲液后加热处理，12% SDS-PAGE电泳分析得出结果。
[0007]phll71-sgc-mut-sd的纯化及最适反应温度测定:上述菌体经超声破碎后直接置于75°C加热30 min,并于12000 r/min, 4 °C条件下离心30 min后，分别取其上清及沉淀制备电泳样，采取12% SDS-PAGE电泳分析。然后，再采用加热离心后的上清作为粗酶液，蛋白含量经Bradford法测定标准化后，以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为水解底物，采用 ρΗ5.6，10mM 醋酸缓冲液，分别于 75°C，80°C，85°C，90°C，95°C，100°C条件下反应 30min,使用DNS法检测反应产物，根据检测结果确定其最适反应温度。
[0008]
【附图说明】
[0009]图1 重组载体 pET21-phll71-sgc-mut_sd 的物理图谱。
[0010]图2热处理后重组菌表达内切-β-1，4-葡聚糖酶的SDS-PAGE分析。1.全蛋白的诱导表达；2.75°C热处理后上清液的诱导表达；3.75°C热处理后沉淀的诱导表达；M.蛋白质分子量标准。
[0011]图3内切-β-l, 4_匍聚糖酶的最适反应温度。
【具体实施方式】
[0012]实施例1内切-β -1，4-葡聚糖酶基因phll71-Sgc-mut-Sd的获得和改造
从掘越氏火球菌A horikoshii (美国菌种保藏中心编号为ATCC700860)中提取基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，引物:
phEG-SG-C-F: 5 , -CAGCAGATCATATGGAAAATACAACATATCAAACACCG-3 ,phEG-SG-C-R: 5 ^ -CTCTAAGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAACTATC-3 ^
Mut-SD-F: 5 z -CGCTTGGTGGGGTGGTAATCTAATG-3 ^
Mut-SD-R: 5 z -CATTAGATTACCACCCCACCAAGCG-3 ^
PCR扩增体系:在0.5ml PCR管仲按顺序加入以下试剂:10X PCR缓冲液5 μ? ； dNTPs混合物(每种 2.5mM) Iμ? ；10 μΜ phEG-SG-C-F ?μ? ；10 μΜ phEG-SG-C-R ?μ? ;基因组 DNA ?μ? ；Vent DNA 聚合酶 0.5μ? ;无菌水 40.5 μ? ；
PCR扩增条件:95°C预变性3min ;95°C变性30 s、55°C退火30 s、72 °C延伸72 s，30个循环；最后72°C延伸5min; 12°C保温，获得内切-β _1，4-葡聚糖酶基因SEQ ID No:1 ；
以 phi 171-sgc 为模板，分别采用 phEG-SG-C-F、Mut-SD-R 和 Mut-SD-F、phEG_SG_C-R 获得不包含类SD序列的phll71-sgc的两个部分，之后采用拼接PCR，获得了不包含SD序列的内切4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut_sd, SEQ ID No:2,该片段经Nde I和NotI双酶切后连入大肠杆菌表达载体pET21a中，获得重组载体pET21-phll71-Sgc-mut-Sd，转化大肠杆菌工程菌株疋coli BL21 (DE3) plys得到重组菌疋coli BL21 (DE3)plys-pET21a-phll71-sgc-mut_sd0
[0013]实施例2
内切_β -1, 4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut-sd的表达
表达条件为37°C，200 r/min, LB培养基培养，接种时加入终浓度为100 Pg/mL的氨苄青霉素，培养至OD600=Q.6，再加入IPTG至终浓度0.1 mM诱导表达3 h。中间分别于诱导后
1.5 h及3 h取样。4167 r/min离心收集菌体,超声波破碎(条件:总时间2 min,开2 s,关2 S，功率50%，冰浴)，取样80 μ?作为全蛋白样品，余样再于12000 r/min,4 °〇条件离心10min，再取80 PL上清作为破菌上清，分别加入20 μ? 5 X SDS PAGE上样缓冲液后加热处理，12% SDS-PAGE电泳分析得出结果。
[0014]实施例3
内切-β -1，4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut-sd的纯化和最适温度测定上述菌体经超声破碎后直接置于75°C加热30 min，并于12000 r/min, 4 °C条件下离心30 min后，分别取其上清及沉淀制备电泳样，采取12% SDS-PAGE电泳分析。然后，再采用加热离心后的上清作为粗酶液，蛋白含量经Bradford法测定标准化后，以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为水解底物，采用ρΗ5.6，100 mM醋酸缓冲液，分别于75°C，80°C，85°C，90°C，95°C，100°C条件下反应30 min,使用DNS法检测反应产物，根据检测结果确定其最适反应温度。
[0015]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种表达内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌的构建方法，其特征是从超嗜热古菌即掘越氏火球菌Pyrococcus horikoshii (美国菌种保藏中心编号为ATCC700860)中提取基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物:phEG-SG-C-F: 5 ^ -CAGCAGATCATATGGAAAATACAACATATCAAACACCG-3 ^phEG-SG-C-R: 5 ^ -CTCTAAGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAACTATC-3 ^Mut-SD-F: 5 z -CGCTTGGTGGGGTGGTAATCTAATG-3 ^Mut-SD-R: 5 z -CATTAGATTACCACCCCACCAAGCG-3 ^ PCR扩增体系:在0.5ml PCR管仲按顺序加入以下试剂:10X PCR缓冲液5 μ? ； dNTPs混合物(每种 2.5mM) Iμ? ；10 μΜ phEG-SG-C-F ?μ? ；10 μΜ phEG-SG-C-R ?μ? ;基因组 DNA ?μ? ；Vent DNA 聚合酶 0.5μ? ;无菌水 40.5 μ? ； PCR扩增条件:95°C预变性3min ;95°C变性30 s、55°C退火30 s、72 °C延伸72 s，30个循环；最后72°C延伸5min; 12°C保温，获得内切-β _1，4-葡聚糖酶基因SEQ ID No:1 ； 以 phll71-sgc 为模板，分别采用 phEG-SG-C-F、Mut-SD-R 和 Mut-SD-F、phEG_SG_C-R 获得不包含类SD序列的phll71-sgc的两个部分，之后采用拼接PCR，获得了不包含SD序列的内切-β-1，4_葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut_sd, SEQ ID No:2，该片段经Nde I和NotI双酶切后连入大肠杆菌表达载体pET21a中，获得重组载体pET21-phll71-Sgc-mut-Sd，转化大肠杆菌工程菌株Ε.coli BL21 (DE3) plys得到重组菌E.coli BL21 (DE3)plys-pET21a-phll71-sgc-mut_sd0
2.不包含SD序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut_sd: SEQ ID No:2。
【专利摘要】一种表达内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌的构建方法，属于基因工程领域。从超嗜热古菌即掘越氏火球菌中通过PCR扩增得到内切-β-1,4-葡聚糖酶基因SEQIDNo.1，接着去除类SD序列并采用拼接PCR，获得了不包含SD序列内切-β-1,4-葡聚糖酶基因ph1171-sgc-mut-sd,SEQIDNo.2，然后将其插入到大肠杆菌表达载体pET21a中，得到重组载体pET21a-ph1171-sgc-mut-sd,转化大肠杆菌工程菌株<i>E.coli</i>BL21(DE3)plys得到重组菌<i>E.coli</i>BL21(DE3)plys-pET21a-ph1171-sgc-mut-sd。由异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，上述重组菌得到高效可溶性表达。通过加热变性处理和离心后，经SDS-PAGE检测重组酶纯度达到80%以上。该酶最适反应温度为95℃。该菌株适合用于纺织行业中降解天然结晶纤维素的过程。
【IPC分类】C12N1-21, C12N15-70, C12R1-19
【公开号】CN104561071
【申请号】CN201310518839
【发明人】杨雪宁, 徐彬, 王巍, 郑春阳
【申请人】天津强微特生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月29日