含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微 环DNA重组母质粒及其构建方法和应用，和一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环 DNA及其构建方法和应用，一种具有含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的宿主细 胞及其应用，以及一种重组嵌合抗原受体及其表达方法和应用。
【背景技术】
[0002] 临床上，重组嵌合抗原受体已被用来治疗各种疾病，包括癌症和自身免疫性疾病 等。但是目前重组嵌合抗原受体一般是在体外生产后再注射到体内进行治疗，这种方式有 多种缺点，比如：（1)生产、包装、运输、保存等环节花费大、成本高；（2)蛋白抗体药物纯度 不高，污染物存在副作用，有安全隐患；（3)抗体的半衰期短，需反复注射，有时还需要用微 泵给药法维持体内抗体的有效浓度，加大了抗体临床应用的难度，且治疗费用高昂。
[0003] 基因治疗采用基因转染的方式将治疗性基因转染到人体靶细胞，是避免直接注射 蛋白抗体药物存在的问题的有效途径之一。在基因治疗中，采用有效的载体高效、安全地将 目的基因转移至宿主细胞内表达非常重要，基因治疗载体有重组腺病毒载体、逆转录病毒 载体和质粒载体。其中，病毒载体在体内的转染率高，但制备病毒载体的费用高昂，且病毒 载体存在插入突变的风险和免疫原性，会带来诱癌风险并可能引发患者致命的免疫反应。 传统的质粒载体比病毒载体安全，但比病毒载体的转染率低，且外源基因只能瞬时表达，如 要稳定持久地表达，载体必须整合到宿主细胞染色体上，而载体的随机整合会引起插入突 变或导致外源基因的沉默，此外，传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、未甲基化 的CpG基序和一些可能隐减的表达 /[目号，这些序列在质粒复制时是必需的，但在基因治疗 中可能引起严重的生物安全性问题。
【发明内容】
[0004] 鉴于此，本发明实施例第一方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微 环DNA重组母质粒，该微环DNA重组母质粒能在宿主菌内完成微环DNA的重组过程，消除原 核质粒元件。
[0005] 本发明实施例第二方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA 重组母质粒的构建方法。
[0006] 本发明实施例第三方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA， 该微环DNA可游离于宿主细胞基因组DNA之外稳定持久的表达重组嵌合抗原受体基因。
[0007] 本发明实施例第四方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA 的构建方法。
[0008] 本发明实施例第五方面提供了一种具有含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环 DNA的宿主细胞。
[0009] 本发明实施例第六方面提供了一种重组嵌合抗原受体。
[0010] 本发明实施例第七方面提供了一种重组嵌合抗原受体的表达方法。
[0011] 本发明实施例第八方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA 重组母质粒、含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA、具有含重组嵌合抗原受体基因表 达盒的微环DNA的宿主细胞和重组嵌合抗原受体的应用。
[0012] 第一方面，本发明提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母 质粒，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点（MCS)中插入重组嵌合抗 原受体基因表达盒的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为ρ2 Φ〇31质粒或pMC. BESPX质粒，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受 体基因、终止密码子和polyA加尾信号。
[0013] 优选地，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列， 所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单 位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜 连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚 单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
[0014] 所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
[0015] 肿瘤细胞抗原表位的结合位点-铰链区-胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨 膜蛋白的跨膜区-活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
[0016] 其中，所述重组嵌合抗原受体为膜受体分子，其肿瘤细胞抗原表位的结合位点通 过铰链区、跨膜区与胞内信号转导区依次相连；所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点具有结 合肿瘤细胞抗原表位的能力，所述铰链区能让该膜受体分子的胞外区，即肿瘤细胞抗原表 位的结合位点充分伸展，保持其肽段的功能完整性，从而充分行使识别、结合肿瘤抗原的功 能；所述跨膜区为连接膜受体分子的胞外抗原识别亚单位和胞内信号转导亚单位的肽段； 所述胞内信号转导亚单位的肽段具有信号转导激活基序。
[0017] 进一步优选地，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区 scFv，所述铰链区为CD8 α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的 α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号 转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
[0018] 更进一步优选地，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所 述第一转导信号为免疫球蛋白Fc ε RI受体的Y链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二 转导信号为⑶27、CD28、4-IBB (CD137)、0X40、CD30、CD40、PD-1 和 ICOS 中的两种。
[0019] ⑶19是B淋巴细胞表面的一种分化抗原，在B淋巴系统恶性肿瘤如急性淋巴细 胞白血病、非何杰金淋巴瘤中广泛表达。而在造血干细胞、浆细胞、T细胞及其他组织中则 没有表达，因此CD19是一种理想的肿瘤治疗靶点。本发明采用的单克隆抗体的单链可变区 scFv包括抗CD19单克隆抗体轻链可变区及重链可变区，该scFv可以直接识别抗原，不需要 以MHC/抗原肽复合物的形式识别抗原，因此不受MHCI类分子的限制。
[0020] 本发明采用的胞内信号转导亚单位包括CD3(链的胞内免疫受体激活基序 (ITAM)和共刺激分子⑶28、⑶137 (4-1BB)胞内信号转导部分，其中，⑶28在促进T细胞产 生IL-2方面优于其他分子，⑶137是记忆性T细胞体外扩增的一个重要的共刺激分子。
[0021] 含本发明提供的重组嵌合抗原受体的T细胞中，含⑶3 ζ -⑶28-⑶137胞内转导信 号的T细胞，在活化的过程中，CD3(链的胞内免疫受体激活基序首先进行磷酸化，然后激 活下游的信号转导分子如CD28、CD137,从而使T细胞充分活化。
[0022] 特别优选地，所述抗⑶19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述 第二转导信号依次包括⑶28和4-IBB，所述⑶28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述 4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为⑶3的ζ链，所述⑶3的 ξ链的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。其中，所述抗⑶19分子单链抗体的包括抗⑶19 分子的轻链和重链，所述轻链和重链之间由连接肽Linker连接，所述Linker的氨基酸序列 为 GSTSGSGKPGSGEGSTKG。
[0023] 更进一步优选地，所述⑶8 α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示；所述 ⑶8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0024] 优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体(肿瘤细胞抗原表位的结合位点-铰链 区-胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区-活化免疫效应细胞的胞内信 号转导区）的氨基酸序列为
[0025] SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:5-SEQ ID N0:6-SEQ ID N0:2-SEQ ID N0:3-SEQ ID N0:4。
[0026] 优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体(肿瘤细胞抗原表位的结合位点-铰链 区-胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区-活化免疫效应细胞的胞内信 号转导区）基因的核苷酸序列为
[0027] SEQ ID N0:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:Il-SEQ ID N0:12-SEQ ID N0:13-SEQ ID NO:14。
[0028] 其中，所述核苷酸序列皆为基因 （DNA片段）两条单链之一的核苷酸序列，横杠 代表各核苷酸序列顺序连接。
[0029] 本发明各核苷酸、氨基酸序列或各多肽之间的横杆""代表各核苷酸、氨基酸序 列或各多肽之间顺序连接，以下同。
[0030] 进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中 的一种。
[0031] 进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、 胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和 甲状腺癌细胞中的一种。
[0032] 以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本发明 所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。
[0033] 进一步优选地，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原 表位。
[0034] 进一步优选地，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信 号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示。
[0035] 进一步优选地，所述编码⑶8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0036] 优选地，所述p2 C>C31质粒构建方法参照Chen ZY et al.，Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo, Molecular Therapy, 2003, Volume8, Number3, 495-500、Chen ZY et al. , Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo, Human Gene Therapy, 2005, Volumel6, Numberl, 126-131 和美国专利 US7897380B2。
[0037] 优选地，所述pMC. BESPX质粒的全基因序列如Chen ZY et al. , A robust system for production of minicircle DNA vectros, Nature Biotechnology, 2010, Volume28, Nu mberl2, 1289-1291 所述。
[0038] 优选地，所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、泛素 UBC 启动子和延长因子EFla启动子。
[0039] 进一步优选地，所述启动子为延伸因子启动子（EF1 a启动子)。
[0040] 该EFl a启动子能使得目的蛋白在NK、T细胞等免疫效应细胞中更高效的表达。
[0041] 优选地,所述EFl a启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0042] 本发明采用的启动子可以为巨细胞病毒CMV、RSV、UBC和EFla等真核表达启动子 之一，EFl a启动子只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选启动子，本发明可以根据表 达宿主细胞的不同等条件选择不同的启动子构建微环DNA母质粒。
[0043] 优选地，所述终止密码子的核苷酸序列为TAG。
[0044] 优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信号。
[0045] 进一步优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA。
[0046] 优选地，所述牛生长激素多聚核苷酸bpA加尾信号的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15 所示。
[0047] 优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体基因表达盒的完整核苷酸序列为：
[0048] SEQ ID N0:16-SEQ ID N0:8-SEQ ID N0:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:Il-SEQ ID N0:12-SEQ ID N0:13-SEQ ID N0:14-TAG-SEQ ID N0:15。
[0049] 本发明采用的polyA加尾信号可以为SV40等polyA加尾信号之一，bpA加尾信号 只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选的加尾信号，本发明可以根据表达宿主细胞的 不同等条件选择不同的加尾信号构建微环DNA母质粒。
[0050] 优选地，所述重组嵌合抗原受体基因由全基因合成或PCR克隆的方式获得。
[0051] 本发明提供的重组嵌合抗原受体中，穿膜连接亚单位能保证受体蛋白分子表达后 锚定在细胞膜上，且穿膜连接亚单位两端的胞外抗原识别亚单位和胞内信号转导亚单位分 别位于细胞膜外、内两侧，从而构成横穿细胞膜的穿膜蛋白；其中，穿膜蛋白的N端为胞外 抗原识别亚单位，C端为胞内信号转导亚单位；从功能上来说，本发明提供的重组嵌合抗原 受体中，其胞外抗原识别亚单位具有结合人肿瘤细胞或病毒感染细胞等细胞表面抗原的功 能域，其胞内信号转导亚单位能促进效应细胞如T淋巴细胞、NK细胞等的激活，且该激活过 程不受MHC I类分子的限制。此外，T淋巴细胞的传统激活途径一般还需要共刺激分子的参 与，因为本发明提供的重组嵌合抗原受体中带有的胞内信号转导亚单位具有第一转导信号 和第二转导信号，该两种信号共刺激分子具有胞内激活基序，能协同使得T细胞分泌的Thl 型细胞因子产生更强、更持久的抗肿瘤效应。
[0052] 优选地，本发明提供的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒具 有编码重组嵌合抗原受体的基因，其中，该重组嵌合抗原受体具有单克隆抗体的单链可变 区scFv为抗CD19scFv抗体，其在激活细胞、产生细胞因子、靶细胞杀伤等方面的作用与双 链TCR相似；连接肽为CD8的铰链区，该区富含脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸，不形成α螺旋，易 发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合；穿膜 连接亚单位为⑶8的α链，其负责将scFv连接在细胞膜上；胞内信号转导亚单位包括第 一转导信号和第二转导信号，其中，第一转导信号为CD3的ζ链，第二转导信号为CD28和 4-ΙΒΒ依次连接的肽段，该第一转导信号和第二转导信号可以协同激活T细胞，产生强大的 靶细胞杀伤效应。
[0053] 第二方面，本发明提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母 质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0054] (1)提供或制备DNA片段，所述DNA片段具有依次连接的重组嵌合抗原受体基因和 终止密码子；
[0055] (2)将步骤（1)所得的DNA片段插入表达载体的多克隆位点，得到含重组嵌合抗 原受体基因表达盒的重组表达载体，其中，所述表达载体的多克隆位点两端分别具有启动 子和po IyA加尾信号；
[0056] (3)将步骤（2)所得的重组表达载体进行双酶切，得到含重组嵌合抗原受体基因表 达盒的DNA片段，然后将所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的DNA片段插入ρ2Φ031质 粒或pMC. BESPX质粒即得含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其中，所 述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原